Биологическое малоугловое рассеяние - это метод малоуглового рассеяния для анализа структуры биологических материалов. Малоугловое рассеяние используется для изучения структуры различных объектов, таких как растворы биологических макромолекул, нанокомпозитов, сплавов и синтетических полимеров. [1] Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей ( МУРР ) и малоугловое рассеяние нейтронов ( МУРН ) - это два дополнительных метода, вместе известных как малоугловое рассеяние (МУР). SAS - это метод, аналогичный рентгеновской и нейтронной дифракции , широкоугольному рассеянию рентгеновских лучей , а также статическому рассеянию света.. В отличие от других методов рассеяния рентгеновских лучей и нейтронов, SAS дает информацию о размерах и формах как кристаллических, так и некристаллических частиц. При использовании для изучения биологических материалов, которые очень часто находятся в водном растворе, картина рассеяния является усредненной по ориентации. [2] [3]
Шаблоны SAS собираются под небольшими углами в несколько градусов. SAS может передавать структурную информацию в диапазоне разрешения от 1 до 25 нм и о повторяющихся расстояниях в частично упорядоченных системах размером до 150 нм. Сверхмалоугловое рассеяние (USAS) позволяет разрешить даже большие размеры. Скользящего падения малоуглового рассеяния (GISAS) является мощным средством для изучения биологических слоев молекул на поверхности.
В биологических приложениях SAS используется для определения структуры частицы с точки зрения среднего размера и формы частицы. Можно также получить информацию о поверхности -До- объема соотношении. Обычно биологические макромолекулы диспергированы в жидкости. Этот метод точен, в основном неразрушающий и обычно требует лишь минимальной подготовки образца. Однако биологические молекулы всегда подвержены радиационному повреждению .
По сравнению с другими методами определения структуры, такими как ЯМР в растворе или рентгеновская кристаллография , SAS позволяет преодолеть некоторые ограничения. Например, ЯМР в растворе ограничен размером белка, тогда как SAS может использоваться как для малых молекул, так и для больших многомолекулярных ансамблей. Твердотельный ЯМР по-прежнему является незаменимым инструментом для определения информации об атомном уровне макромолекул более 40 кДа или некристаллических образцов, таких как амилоидные фибриллы. Определение структуры с помощью рентгеновской кристаллографии может занять несколько недель или даже лет, тогда как измерения SAS занимают дни. SAS также можно сочетать с другими аналитическими методами, такими как эксклюзионная хроматография, для исследования гетерогенных образцов. [4] Однако с помощью SAS невозможно измерить положение атомов в молекуле.
Методика
Концептуально эксперименты по малоугловому рассеянию просты: образец подвергается воздействию рентгеновских лучей или нейтронов, а рассеянное излучение регистрируется детектором. Поскольку измерения SAS выполняются очень близко к первичному пучку («малые углы»), для этого метода требуется сильно коллимированный или сфокусированный пучок рентгеновских лучей или нейтронов. Биологическое малоугловое рассеяние рентгеновских лучей часто выполняется на источниках синхротронного излучения , поскольку биологические молекулы обычно слабо рассеиваются, а измеряемые растворы разбавлены . Биологический метод МУРР основан на высокой интенсивности пучков рентгеновских фотонов, обеспечиваемых накопительными кольцами синхротрона . Кривая рассеяния рентгеновских лучей или нейтронов ( зависимость интенсивности от угла рассеяния ) используется для создания модели белка с низким разрешением, показанной здесь на правом рисунке. Кроме того, можно использовать данные рассеяния рентгеновских лучей или нейтронов и поместить отдельные домены (структуры рентгеновских лучей или ЯМР ) в "оболочку SAXS".
В эксперименте по рассеянию раствор макромолекул подвергается воздействию рентгеновских лучей (с длиной волны λ обычно около 0,15 нм) или тепловых нейтронов ( λ ≈ 0,5 нм). Интенсивность рассеяния I (s) регистрируется как функция переданного импульса s ( s = 4πsinθ / λ , где 2θ - угол между падающим и рассеянным излучением). Из интенсивности раствора вычитается рассеяние только от растворителя. Случайные положения и ориентации частиц приводят к изотропному распределению интенсивности, которое для монодисперсных невзаимодействующих частиц пропорционально рассеянию от одной частицы, усредненному по всем ориентациям. Чистое рассеяние частиц пропорционально квадрату разницы в плотности длины рассеяния ( электронной плотности для рентгеновских лучей и ядерной / спиновой плотности для нейтронов) между частицей и растворителем - так называемый контраст. Контраст может быть изменен при рассеянии нейтронов с использованием смесей H 2 O / D 2 O или селективного дейтерирования для получения дополнительной информации. [1] Информационное содержание данных SAS проиллюстрировано здесь, на рисунке справа, который показывает картины рассеяния рентгеновских лучей от белков с разными складками и молекулярными массами . При малых углах (разрешение 2-3 нм) кривые представляют собой быстро убывающие функции s, в основном определяемые формой частиц, которые явно различаются. При среднем разрешении (от 2 до 0,5 нм) различия уже менее выражены, а при разрешении выше 0,5 нм все кривые очень похожи. [5] Таким образом, SAS содержит информацию о грубых структурных особенностях - форме, четвертичной и третичной структуре - но не подходит для анализа атомной структуры.
История
Первые приложения относятся к концу 1930-х годов, когда основные принципы МУРР были разработаны в фундаментальной работе Гинье после его исследований металлических сплавов. В первой монографии МУРР Гинье и Фурне уже было продемонстрировано, что метод дает не только информацию о размерах и форме частиц, но и о внутренней структуре неупорядоченных и частично упорядоченных систем.
В 1960-х годах этот метод стал приобретать все большее значение в изучении биологических макромолекул в растворах, поскольку он позволял получать структурную информацию с низким разрешением об общей форме и внутренней структуре в отсутствие кристаллов. Прорыв в экспериментах с МУРР и МУРН произошел в 1970-х годах благодаря доступности источников синхротронного излучения и нейтронов, последние проложили путь для изменения контраста путем замены растворителя H 2 O на D 2 O и специальных методов дейтерирования. Стало понятно, что исследования рассеяния на растворе дают при минимальных затратах времени и усилий полезное понимание структуры некристаллических биохимических систем. Кроме того, SAXS / SANS также сделал возможным в реальном времени исследования межмолекулярных взаимодействий, включая сборку и крупномасштабные конформационные изменения в макромолекулярных сборках .
Основная задача САС как структурного метода - извлечь информацию о трехмерной структуре объекта из одномерных экспериментальных данных. В прошлом только общие параметры частиц (например, объем, радиус вращения) макромолекул определялись непосредственно из экспериментальных данных, тогда как анализ в рамках трехмерных моделей ограничивался простыми геометрическими телами (например, эллипсоидами, цилиндрами и т. Д.) .) или было выполнено специальным методом проб и ошибок. Электронная микроскопия часто использовалась как ограничение при построении консенсусных моделей. В 1980-х годах прогресс в других структурных методах привел к снижению интереса биохимиков к исследованиям SAS, которые делали структурные выводы только на основе нескольких общих параметров или основывались на моделях проб и ошибок.
1990-е годы стали прорывом в методах анализа данных SAXS / SANS, которые открыли путь для надежного ab initio моделирования макромолекулярных комплексов, включая детальное определение формы и доменной структуры и применение методов уточнения твердого тела. Этот прогресс сопровождался дальнейшими достижениями в инструментарии, позволяющем достигать временного разрешения менее миллисекунд на источниках СИ третьего поколения в исследованиях сворачивания белков и нуклеиновых кислот. [1]
В 2005 году стартовал четырехлетний проект. S mall- ngle X -Ray рассеяния I nitiative для E U R ОП (SAXIER) с целью объединить методы SAXS с другими аналитическими методами и создать автоматизированное программное обеспечение для быстрого анализа больших объемов данных. В рамках проекта была создана единая европейская инфраструктура SAXS с использованием самых современных доступных методов. [6]
Анализ данных
В SAS-эксперименте хорошего качества измеряются несколько растворов с различными концентрациями исследуемой макромолекулы. Экстраполируя кривые рассеяния, измеренные при различных концентрациях, на нулевую концентрацию, можно получить кривую рассеяния, которая представляет бесконечное разбавление. Тогда эффекты концентрации не должны влиять на кривую рассеяния. Анализ данных экстраполированной кривой рассеяния начинается с проверки начала кривой рассеяния в области около s = 0 . Если область соответствует приближению Гинье (также известному как закон Гинье ), выборка не агрегируется . Затем форму рассматриваемой частицы можно определить различными методами, некоторые из которых описаны в следующей ссылке. [1]
Косвенное преобразование Фурье
Первым шагом обычно является вычисление преобразования Фурье кривой рассеяния. Преобразованную кривую можно интерпретировать как функцию распределения по расстояниям внутри частицы. Это преобразование дает также преимущество регуляризации входных данных. [ необходима цитата ]
Модели с низким разрешением
Одна из проблем в анализе данных SAS - получить трехмерную структуру из одномерной картины рассеяния. Данные SAS не предполагают единого решения. Например, многие разные белки могут иметь одинаковую кривую рассеяния. Реконструкция трехмерной структуры может привести к созданию большого количества различных моделей. Чтобы избежать этой проблемы, необходимо рассмотреть ряд упрощений.
Дополнительный подход заключается в объединении данных и модели малоуглового рентгеновского излучения и рассеяния нейтронов с программой MONSA.
Бесплатные компьютерные программы анализа SAS интенсивно разрабатывались в EMBL . В первом общем ab initio подходе угловая огибающая частицы r = F (ω) , где ( r, ω ) - сферические координаты, описывается серией сферических гармоник . Таким образом, форма с низким разрешением определяется несколькими параметрами - коэффициентами этого ряда - которые соответствуют данным рассеяния. Подход получил дальнейшее развитие и реализован в компьютерной программе SASHA ( Small Angle Scattering Shape Determination ). [7] [8] Было продемонстрировано, что при определенных обстоятельствах уникальная огибающая может быть извлечена из данных рассеяния. Этот метод применим только к глобулярным частицам относительно простой формы и без значительных внутренних полостей. Чтобы преодолеть эти ограничения, был разработан другой подход, в котором используются различные типы поиска по методу Монте-Карло. DALAI_GA - элегантная программа, которая берет сферу с диаметром, равным максимальному размеру частиц Dmax, который определяется из данных рассеяния, и заполняет ее шариками. Каждая гранула принадлежит либо частице (индекс = 1), либо растворителю (индекс = 0). Таким образом, форма описывается двоичной строкой длины M. Начиная со случайной строки, генетический алгоритм ищет модель, которая соответствует данным. При поиске, реализованном в программе DAMMIN, накладываются ограничения на компактность и связность . [9] [10] Если симметрия частицы известна, SASHA и DAMMIN могут использовать ее в качестве полезных ограничений. Процедура «отдавай и принимай» SAXS3D и программа SASMODEL , основанная на взаимосвязанных эллипсоидах, являются ab initio подходами Монте-Карло без ограничений в области поиска. [5]
Подход, который использует ансамбль фиктивных остатков (DR) и моделирование отжига для построения локальной «цепно-совместимой» DR-модели внутри сферы диаметром Dmax, позволяет извлечь больше деталей из данных SAXS. Этот метод реализован в программе GASBOR . [11] [12]
Картины рассеяния в растворе многодоменных белков и макромолекулярных комплексов также можно подобрать с помощью моделей, построенных на основе структур высокого разрешения ( ЯМР или рентгеновские лучи ) отдельных доменов или субъединиц, предполагая, что их третичная структура сохраняется. В зависимости от сложности объекта используются разные подходы к глобальному поиску оптимальной конфигурации субъединиц, соответствующей экспериментальным данным.
Модель консенсуса
Модели на основе Монте-Карло содержат сотни или тысячи параметров, и следует соблюдать осторожность, чтобы избежать чрезмерной интерпретации. Общий подход состоит в том, чтобы выровнять набор моделей, полученных в результате независимых прогонов реконструкции формы, чтобы получить усредненную модель, сохраняющую наиболее устойчивые и, возможно, также самые надежные особенности (например, с использованием программы SUPCOMB ). [5] [13] [14]
Добавление недостающих петель
Неупорядоченные поверхностные аминокислоты (« петли ») часто не наблюдаются в ЯМР и кристаллографических исследованиях и могут отсутствовать в представленных моделях. Такие неупорядоченные элементы вносят вклад в интенсивность рассеяния, и их вероятные местоположения можно найти, зафиксировав известную часть структуры и добавив недостающие части, чтобы они соответствовали картине SAS от всей частицы. Подход Dummy Residue был расширен, а алгоритмы добавления недостающих циклов или доменов были реализованы в программном пакете CREDO . [5]
Гибридные методы
Недавно было предложено несколько методов, использующих данные SAXS в качестве ограничений. Авторы стремились улучшить результаты методов распознавания складок [15] и предсказания структуры белков de novo [16] . Данные SAXS обеспечивают преобразование Фурье гистограммы парных атомных расстояний (функция распределения пар) для данного белка. Это может служить структурным ограничением для методов, используемых для определения нативной конформационной складки белка. Распознавание нитей или складок предполагает, что трехмерная структура более консервативна, чем последовательность. Таким образом, очень расходящиеся последовательности могут иметь похожую структуру. С другой стороны, методы ab initio бросают вызов одной из самых больших проблем в молекулярной биологии, а именно, предсказать сворачивание белка «с нуля», не используя гомологичные последовательности или структуры. Используя «фильтр SAXS», авторы смогли значительно очистить набор моделей белков de novo. [16] Это было дополнительно доказано поисками структурных гомологий . Также было показано, что комбинация оценок SAXS с оценками, используемыми в методах многопоточности, значительно улучшает производительность распознавания сверток. [15] На одном примере было продемонстрировано, как приблизительную третичную структуру модульных белков можно собрать из структур доменов ЯМР высокого разрешения, используя данные SAXS, ограничивая трансляционные степени свободы. [17] Другой пример показывает, как данные SAXS могут быть объединены вместе с ЯМР, рентгеновской кристаллографией и электронной микроскопией для восстановления четвертичной структуры многодоменного белка. [18]
Гибкие системы
Недавно был предложен элегантный метод решения проблемы изначально неупорядоченных или многодоменных белков с гибкими линкерами . [19] Это допускает сосуществование различных конформаций белка, которые вместе вносят вклад в усредненную экспериментальную картину рассеяния. Первоначально EOM (метод оптимизации ансамбля) генерирует пул моделей, охватывающих пространство конфигурации белков. Затем для каждой модели рассчитывается кривая рассеяния. На втором этапе программа выбирает подмножества моделей белков. Среднее экспериментальное рассеяние рассчитывается для каждого подмножества и соответствует экспериментальным данным МУРР. Если наилучшее совпадение не найдено, модели перетасовываются между разными подмножествами, выполняется новый расчет среднего рассеяния и подгонка к экспериментальным данным. Этот метод был протестирован на двух белках - денатурированном лизоциме и протеинкиназе Брутона . Это дало интересные и многообещающие результаты. [19]
Слои биологических молекул и GISAS
Покрытия биомолекул можно изучать с помощью рентгеновских лучей скользящего падения и рассеяния нейтронов. IsGISAXS ( малоугловое рассеяние рентгеновских лучей при скользящем падении ) - это программа, предназначенная для моделирования и анализа GISAXS на основе наноструктур. IsGISAXS охватывает только рассеяние частицами нанометрового размера, которые погребены в недрах матрицы, поддерживаются на подложке или закопаны тонким слоем на подложке. Также рассматривается случай дырок. Геометрия ограничена плоскостью частиц. Сечение рассеяния разложено на интерференционную функцию и форм-фактор частицы . Акцент делается на геометрии скользящего падения, которая вызывает «эффект преломления луча». Форм- фактор частицы рассчитывается в рамках приближения Борна с искаженной волной (DWBA), начиная с невозмущенного состояния с резкими границами раздела или с фактическим перпендикулярным профилем показателя преломления . Доступны различные виды простых геометрических форм с полным учетом распределения размеров и форм в приближении развязки (DA), в локальном монодисперсном приближении (LMA), а также в приближении корреляции размера и расстояния (SSCA). Рассмотрены как неупорядоченные системы частиц, определяемые их парной корреляционной функцией частица-частица, так и двумерный кристалл или пара-кристалл. [20]
Смотрите также
- Антон Паар
- Bruker
- Электронная микроскопия
- Флуктуационное рассеяние рентгеновских лучей (FXS)
- Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей при скользящем падении ( GISAXS )
- Гомологическое моделирование
- Нейтронное спиновое эхо
- Банк данных белков
- Белковая динамика
- Сворачивание белков
- Протеиновая нить
- Ригаку
- Rosetta @ home
- Рентгеновская кристаллография
Рекомендации
- ^ a b c d Свергун Д.И., Кох М.Х. (2003). «Малоугловое рассеяние биологических макромолекул в растворе». Rep. Prog. Phys . 66 (10): 1735–82. Bibcode : 2003RPPh ... 66.1735S . DOI : 10.1088 / 0034-4885 / 66/10 / R05 . S2CID 9305500 .
- ^ Хо Д.Л., Бирнс В.М., Ма В.П., Ши Й., Каллауэй Д.И., Бу Зи (сентябрь 2004 г.). «Структурно-специфические ДНК-индуцированные конформационные изменения в полимеразе Taq, обнаруженные с помощью малоуглового рассеяния нейтронов» . Журнал биологической химии . 279 (37): 39146–54. DOI : 10.1074 / jbc.M404565200 . PMID 15247286 .
- ^ Lipfert J, Doniach S (1 июня 2007 г.). «Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей от РНК, белков и белковых комплексов». Ежегодный обзор биофизики и структуры биомолекул . 36 (1): 307–27. DOI : 10.1146 / annurev.biophys.36.040306.132655 . PMID 17284163 .
- ^ Мейсбургер С.П., Томас В.К., Уоткинс МБ, Андо Н. (июнь 2017 г.). "Исследование структурной динамики белков с помощью рассеяния рентгеновских лучей" . Химические обзоры . 117 (12): 7615–7672. DOI : 10.1021 / acs.chemrev.6b00790 . PMC 5562295 . PMID 28558231 .
- ^ а б в г Свергун Д.И., Кох М.Х. (октябрь 2002 г.). «Достижения в структурном анализе с использованием малоуглового рассеяния в растворе». Текущее мнение в структурной биологии . 12 (5): 654–60. DOI : 10.1016 / S0959-440X (02) 00363-9 . PMID 12464319 .
- ^ "SAXIER: Инициатива по малоугловому рассеянию рентгеновских лучей для Европы" .
- ^ "САША: Определение формы малоуглового рассеяния" . Группа биологического малоуглового рассеяния . EMBL Гамбург.
- ^ Свергун Д.И., Волков В.В., Козин М.Б., Штурманн Х.Б. (1996). «Новые разработки в области прямого определения формы по малоугловому рассеянию. 2. Уникальность» . Acta Crystallogr . A52 (6): 419–426. DOI : 10.1107 / S0108767391006414 .
- ^ «DAMMIN: Ab initio определение формы путем имитации отжига с использованием однофазной модели фиктивного атома» . Группа биологического малоуглового рассеяния . EMBL Гамбург.
- ^ Свергун Д.И. (июнь 1999 г.). «Восстановление структуры биологических макромолекул с низким разрешением по рассеянию раствора с использованием имитации отжига» . Биофизический журнал . 76 (6): 2879–86. Bibcode : 1999BpJ .... 76.2879S . DOI : 10.1016 / S0006-3495 (99) 77443-6 . PMC 1300260 . PMID 10354416 .
- ^ "GASBOR: Ab initio реконструкция структуры белка цепочечным ансамблем фиктивных остатков" . Группа биологического малоуглового рассеяния . EMBL Гамбург.
- ^ Свергун Д.И., Петухов М.В., Кох М.Х. (июнь 2001 г.). «Определение доменной структуры белков по рассеянию рентгеновских лучей в растворе» . Биофизический журнал . 80 (6): 2946–53. Bibcode : 2001BpJ .... 80.2946S . DOI : 10.1016 / S0006-3495 (01) 76260-1 . PMC 1301478 . PMID 11371467 .
- ^ «СУПКОМБ» . Группа биологического малоуглового рассеяния . EMBL Гамбург.
- ^ Козин М.Б., Свергун Д.И. (2001). «Автоматическое сопоставление структурных моделей высокого и низкого разрешения». J. Appl. Кристаллогр . 34 : 33–41. DOI : 10.1107 / S0021889800014126 .
- ^ а б Чжэн В., Донич С. (май 2005 г.). «Распознавание складок, чему способствуют ограничения данных малоуглового рассеяния рентгеновских лучей» . Белковая инженерия, дизайн и отбор . 18 (5): 209–19. DOI : 10,1093 / белок / gzi026 . PMID 15845555 .
- ^ а б Чжэн В., Донич С. (февраль 2002 г.). «Прогнозирование структуры белка ограничено данными рассеяния рентгеновских лучей в растворе и идентификацией структурной гомологии». Журнал молекулярной биологии . 316 (1): 173–87. DOI : 10.1006 / jmbi.2001.5324 . PMID 11829511 . S2CID 2970219 .
- ^ Маттинен М.Л., Пяэкконен К., Иконен Т., Кравен Дж., Дракенберг Т., Серимаа Р., Вальто Дж., Аннила А. (август 2002 г.). «Четвертичная структура, построенная из субъединиц, объединяющих данные ЯМР и малоуглового рентгеновского рассеяния» . Биофизический журнал . 83 (2): 1177–83. Bibcode : 2002BpJ .... 83.1177M . DOI : 10.1016 / S0006-3495 (02) 75241-7 . PMC 1302219 . PMID 12124297 .
- ^ Tidow H, Melero R, Mylonas E, Freund SM, Grossmann JG, Carazo JM, Svergun DI, Valle M, Fersht AR (июль 2007 г.). «Четвертичные структуры супрессора опухолей р53 и специфический комплекс ДНК р53» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 104 (30): 12324–9. Bibcode : 2007PNAS..10412324T . DOI : 10.1073 / pnas.0705069104 . PMC 1941468 . PMID 17620598 .
- ^ а б Бернадо П., Милонас Э., Петухов М.В., Блэкледж М., Свергун Д.И. (май 2007 г.). «Структурная характеристика гибких белков с помощью малоуглового рассеяния рентгеновских лучей». Журнал Американского химического общества . 129 (17): 5656–64. DOI : 10.1021 / ja069124n . PMID 17411046 .
- ^ «IsGISAXS: программа для анализа малоуглового рентгеновского рассеяния от наноструктур при скользящем падении» . Архивировано из оригинального 22 мая 2012 года.
дальнейшее чтение
- Кох М.Х., Вачетт П., Свергун Д.И. (май 2003 г.). «Малоугловое рассеяние: взгляд на свойства, структуру и структурные изменения биологических макромолекул в растворе». Ежеквартальные обзоры биофизики . 36 (2): 147–227. DOI : 10.1017 / S0033583503003871 . PMID 14686102 .
- Петухов М.В., Свергун Д.И. (август 2005 г.). «Глобальное твердотельное моделирование макромолекулярных комплексов по данным малоуглового рассеяния» . Биофизический журнал . 89 (2): 1237–50. Bibcode : 2005BpJ .... 89.1237P . DOI : 10.1529 / biophysj.105.064154 . PMC 1366608 . PMID 15923225 .
- Бернадо П., Блэкледж М. (декабрь 2010 г.). «Структурная биология: белки в динамическом равновесии» . Природа . 468 (7327): 1046–8. Bibcode : 2010Natur.468.1046B . DOI : 10.1038 / 4681046a . PMID 21179158 .
Внешние ссылки
- SAXS / WAXS Beamline Australian Synchrotron , Мельбурн, Австралия
- СИВИЛЛА - луч в Advanced Light Source , Беркли, США
- МУРР - на экспериментальная станция источника синхротронного излучения ELETTRA синхротронного света лаборатории , Триест, Италия
- X33 - луч в DESY , Гамбург, Германия
- D11A [ мертвая ссылка ] - линия пучка в Бразильской лаборатории синхротронного света , Кампинас, Бразилия
- X21 и X9 - лучи в Национальном источнике синхротронного света в Брукхейвенской национальной лаборатории , Аптон, США
- F2 и G1 - лучи в Корнельской лаборатории ускорительных наук и образования , Итака, США
- Био-SANS - на экспериментальной станция источник синхротронного излучения высоких изотопного реакторе в Oak Ridge National Laboratory , Oak Ridge, TN, США