Целлюлаза - это любой из нескольких ферментов, вырабатываемых в основном грибами , бактериями и простейшими, которые катализируют целлюлолиз , разложение целлюлозы и некоторых родственных полисахаридов . Это название также используется для любой встречающейся в природе смеси или комплекса различных таких ферментов, которые действуют последовательно или синергетически, разлагая целлюлозный материал.
Целлюлаза | ||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Идентификаторы | ||||||||
ЕС нет. | 3.2.1.4 | |||||||
№ CAS | 9012-54-8 | |||||||
Базы данных | ||||||||
IntEnz | Просмотр IntEnz | |||||||
BRENDA | BRENDA запись | |||||||
ExPASy | Просмотр NiceZyme | |||||||
КЕГГ | Запись в KEGG | |||||||
MetaCyc | метаболический путь | |||||||
ПРИАМ | профиль | |||||||
Структуры PDB | RCSB PDB PDBe PDBsum | |||||||
Генная онтология | Amigo / QuickGO | |||||||
|
Целлюлазы расщепляют молекулу целлюлозы на моносахариды («простые сахара»), такие как бета- глюкоза , или более короткие полисахариды и олигосахариды . Распад целлюлозы имеет большое экономическое значение, потому что он делает основной компонент растений доступным для потребления и использования в химических реакциях. Конкретная вовлеченная реакция - это гидролиз 1,4- бета-D- гликозидных связей в целлюлозе, гемицеллюлозе , лихенине и бета-D- глюканах злаков . Поскольку молекулы целлюлозы прочно связываются друг с другом, целлюлолиз относительно труден по сравнению с распадом других полисахаридов, таких как крахмал. [2]
Большинство млекопитающих имеют очень ограниченную способность переваривать пищевые волокна, такие как целлюлоза, сами по себе. У многих травоядных животных, таких как жвачные, такие как крупный рогатый скот и овцы, и у ферментеров задней кишки, таких как лошади, целлюлазы продуцируются симбиотическими бактериями. Эндогенные целлюлазы вырабатываются несколькими типами многоклеточных животных, такими как термиты , улитки [3] [4] [5] и дождевые черви .
Недавно целлюлазы были также обнаружены в зеленых микроводорослях ( Chlamydomonas reinhardtii , Gonium pectorale и Volvox carteri ), и их каталитические домены (CD), принадлежащие к семейству GH9, демонстрируют наивысшую гомологию последовательностей с эндогенными целлюлазами многоклеточных животных . Целлюлазы водорослей являются модульными, состоящими из предполагаемых новых богатых цистеином углеводсвязывающих модулей (CBM), богатых пролином / серином (PS) линкеров в дополнение к предполагаемым Ig-подобным и неизвестным доменам в некоторых членах. Целлюлаза из Gonium pectorale состояла из двух CD, разделенных линкерами, и с C-концевой CBM. [6]
Известно несколько различных видов целлюлаз, которые различаются по структуре и механизму. Синонимы, производные и специфические ферменты, связанные с названием «целлюлаза», включают эндо-1,4-бета-D-глюканазу (бета-1,4-глюканаза, бета-1,4-эндоглюкан гидролаза, эндоглюканаза D, 1,4 - (1,3,1,4) -бета-D-глюкан-4-глюканогидролаза), карбоксиметилцеллюлаза (CMCase), авицелаза, целлюдекстриназа , целлюлаза A , целлюлозин AP , щелочная целлюлаза , целлюлаза A 3 , целлюлаза 9,5 и панцеллаза SS . Ферменты, расщепляющие лигнин , иногда называли целлюлазами, но это старое использование не рекомендуется; они являются ферментами, модифицирующими лигнин .
Виды и действие
Пять основных типов целлюлаз в зависимости от типа катализируемой реакции:
- Эндоцеллюлазы (EC 3.2.1.4) случайным образом расщепляют внутренние связи в аморфных сайтах, которые создают новые концы цепи.
- Экзоцеллюлазы или целлобиогидролазы (EC 3.2.1.91) отщепляют от двух до четырех единиц на концах открытых цепей, продуцируемых эндоцеллюлазой, что приводит к тетрасахаридам [7] или дисахаридам , таким как целлобиоза . Экзоцеллюлазы далее подразделяются на тип I, который действует процессивно с восстанавливающего конца цепи целлюлозы, и тип II, который действует процессивно с невосстанавливающего конца.
- Целлобиазы (EC 3.2.1.21) или бета-глюкозидазы гидролизуют продукт экзоцеллюлазы до индивидуальных моносахаридов.
- Окислительные целлюлазы деполимеризуют целлюлозу посредством радикальных реакций, как, например, целлобиозодегидрогеназа (акцептор) .
- Фосфорилазы целлюлозы деполимеризуют целлюлозу с использованием фосфатов вместо воды.
Авицелаза обладает почти исключительно экзоцеллюлазной активностью, поскольку авицелза представляет собой субстрат с высокой микрокристаллической структурой.
Среди вышеперечисленных типов есть также прогрессивные (также известные как процессивные) и непрогрессивные типы. Прогрессивная целлюлаза будет продолжать взаимодействовать с одной полисахаридной цепью, непрогрессивная целлюлаза будет взаимодействовать один раз, а затем отсоединиться и задействовать другую полисахаридную цепочку.
Действие целлюлазы считается синергическим, поскольку все три класса целлюлазы могут давать гораздо больше сахара, чем добавление всех трех по отдельности. Помимо жвачных, большинство животных (включая людей) не производят целлюлазу в своем организме и могут лишь частично расщеплять целлюлозу путем ферментации, что ограничивает их способность использовать энергию в волокнистом растительном материале.
Состав
Большинство грибковых целлюлаз имеют двухдоменную структуру с одним каталитическим доменом и одним целлюлозосвязывающим доменом, которые соединены гибким линкером. Эта структура адаптирована для работы с нерастворимым субстратом и позволяет ферменту двумерно диффундировать по поверхности, как гусеница. Однако есть также целлюлазы (в основном эндоглюканазы), в которых отсутствуют целлюлозосвязывающие домены.
Как связывание субстратов, так и катализ зависят от трехмерной структуры фермента, которая возникает как следствие уровня сворачивания белка . Аминокислотная последовательность и расположение их остатков в активном центре, положение, в котором связывается субстрат, могут влиять на такие факторы, как сродство связывания лигандов, стабилизация субстратов в активном центре и катализ. Структура субстрата дополняет точную структуру активного центра фермента. Изменения положения остатков могут привести к нарушению одного или нескольких из этих взаимодействий. [8] Дополнительные факторы, такие как температура, pH и ионы металлов, влияют на нековалентные взаимодействия между структурой ферментов. [9] Виды Thermotoga maritima производят целлюлазы, состоящие из 2 бета-слоев (белковых структур), окружающих центральную каталитическую область, которая является активным центром. [10] Фермент классифицируется как эндоглюканаза, которая внутренне расщепляет β-1,4-гликозидные связи в целлюлозных цепях, облегчая дальнейшее разложение полимера. Различные виды из того же семейства, что и T. Maritima, образуют целлюлазы с разной структурой. [10] Целлюлазы, продуцируемые видом Coprinopsis Cinerea, состоят из семи белковых цепей в форме закрытого туннеля, называемого бета / альфа-стволом. [11] Эти ферменты гидролизуют карбоксиметилцеллюлозу субстрата. Связывание субстрата в активном центре вызывает изменение конформации, что делает возможной деградацию молекулы.
Целлюлазные комплексы
У многих бактерий целлюлазы in vivo представляют собой сложные ферментные структуры, организованные в супрамолекулярные комплексы , целлюлосомы . Они могут содержать, но не ограничиваются ими, пять различных ферментных субъединиц, представляющих, а именно эндоцеллюлазы, экзоцеллюлазы, целлобиазы, окислительные целлюлазы и фосфорилазы целлюлозы, при этом только экзоцеллюлазы и целлобиазы участвуют в фактическом гидролизе связи β (1 → 4). Количество субъединиц, составляющих целлюлосомы, также может определять степень активности фермента. [12]
Многодоменные целлюлазы широко распространены среди многих таксономических групп, однако целлюлазы анаэробных бактерий, обнаруженные в целлюлосомах, имеют наиболее сложную архитектуру, состоящую из различных типов модулей. Например, Clostridium cellulolyticum продуцирует 13 модульных целлюлаз GH9, содержащих различное количество и расположение каталитического домена (CD), углеводсвязывающего модуля (CBM), докерина, линкера и Ig-подобного домена. [13]
Комплекс целлюлазы из Trichoderma reesei , например, включает компонент, обозначенный C1 (57000 дальтон ), который разделяет цепи кристаллической целлюлозы, эндоглюканазы (около 52000 дальтон), экзоглюканазы (около 61000 дальтон) и бета-глюкозидазы (76000 дальтон). дальтон). [14]
В геномах бактерий, продуцирующих целлюлосомы , были идентифицированы многочисленные «сигнатурные» последовательности, известные как докерины и когезины . В зависимости от их аминокислотной последовательности и третичной структуры целлюлазы делятся на кланы и семейства. [15]
Мультимодульные целлюлазы более эффективны, чем свободный фермент (только с CD) из-за синергизма из-за непосредственной близости между ферментом и целлюлозным субстратом. CBM участвуют в связывании целлюлозы, тогда как гликозилированные линкеры обеспечивают гибкость CD для более высокой активности и защиты протеазы, а также повышенного связывания с поверхностью целлюлозы. [6]
Механизм целлюлолиза
Использует
Целлюлаза используется для производства кофе в коммерческих целях . Он выполняет гидролиз целлюлозы во время сушки бобов . Кроме того, целлюлазы широко используются в текстильной промышленности и в стиральных порошках. Они также использовались в целлюлозно-бумажной промышленности для различных целей и даже в фармацевтике. Целлюлаза используется при ферментации биомассы в биотопливо , хотя в настоящее время этот процесс является относительно экспериментальным. С медицинской точки зрения целлюлаза используется для лечения фитобезоаров, формы безоара целлюлозы, обнаруживаемой в желудке человека , и она продемонстрировала эффективность в разрушении полимикробных бактериальных биопленок путем гидролиза β (1-4) гликозидных связей в структурных экзополисахаридах матрикса внеклеточное полимерное вещество (EPS). [17] [18]
Измерение
Поскольку природный субстрат, целлюлоза , представляет собой нерастворимый в воде полимер, традиционные методы анализа восстанавливающего сахара с использованием этого субстрата не могут быть использованы для измерения активности целлюлазы. Ученые-аналитики разработали ряд альтернативных методов.
- Метод DNSA. Целлюлазную активность определяли путем инкубации 0,5 мл супернатанта с 0,5 мл 1% карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) в 0,05 М цитратном буфере (pH 4,8) при 50 ° C в течение 30 минут. Реакцию останавливали добавлением 3 мл реагента динитросалициловой кислоты. Поглощение считывали при 540 нм. [19]
Вискозиметр может быть использован для измерения снижения вязкости раствора , содержащего водорастворимое производное целлюлозы , такие как карбоксиметилцеллюлоза при инкубации с образцом целлюлазы. [20] Снижение вязкости прямо пропорционально активности целлюлазы. В то время как такие анализы очень чувствительны и специфичны для эндо -cellulase ( экзо -Актерских целлюлазы ферменты производят мало или вообще не изменение вязкости), они ограничены тем , что трудно определить активность в условных единицах фермента (микромолей субстрат или гидролизованный продукта, произведенного в минуту).
Целлоолигосахаридные субстраты
Целлоолигосахариды с более низким DP (DP2-6) достаточно растворимы в воде, чтобы действовать как жизнеспособные субстраты для ферментов целлюлазы. [21] Однако, поскольку эти субстраты сами по себе являются « восстанавливающими сахарами », они не подходят для использования в традиционных анализах содержания восстанавливающего сахара, поскольку они генерируют высокое «холостое» значение. Однако их гидролиз, опосредованный целлюлазой, можно контролировать методами ВЭЖХ или IC, чтобы получить ценную информацию о потребности в субстрате конкретного фермента целлюлазы.
Восстановленные целлоолигосахаридные субстраты
Целлоолигосахариды можно химически восстановить под действием боргидрида натрия с образованием соответствующих сахарных спиртов . Эти соединения не реагируют в тестах на восстановление сахара, но их продукты гидролиза реагируют. Это делает восстановленные борогидридом целлоолигосахариды ценными субстратами для анализа целлюлазы с использованием традиционных анализов на содержание восстанавливающего сахара, таких как метод Нельсона-Симоджи. [22] [23]
Окрашенные полисахаридные субстраты
[24]
Эти подложки можно разделить на два класса:
- Нерастворимые хромогенные субстраты: нерастворимый субстрат целлюлазы, такой как AZCL-HE-целлюлоза, абсорбирует воду и создает гелеобразные частицы при помещении в раствор. Этот субстрат постепенно деполимеризуется и растворяется под действием целлюлазы. Реакцию останавливают добавлением щелочного раствора, чтобы остановить активность фермента, и реакционную суспензию фильтруют или центрифугируют. Цвет фильтрата или надосадочной жидкости измеряется и может быть связан с активностью фермента.
- Растворимые хромогенные субстраты: образец целлюлазы инкубируют с водорастворимым субстратом, таким как азо-CM-целлюлоза, реакция прекращается и высокомолекулярные частично гидролизованные фрагменты осаждаются из раствора с органическим растворителем, таким как этанол или метоксиэтанол. Суспензию тщательно перемешивают, центрифугируют и измеряют цвет надосадочного раствора (из-за небольших растворимых окрашенных фрагментов). С помощью стандартной кривой можно определить активность фермента.
Реагенты, связанные с ферментами
В последнее время , новые реагенты были разработаны , которые позволяют для измерения удельного от эндо -cellulase. [25] [26] Эти методы включают использование функционализированных олигосахаридных субстратов в присутствии вспомогательного фермента. В показанном примере фермент целлюлаза способен распознавать трисахаридный фрагмент целлюлозы и расщеплять эту единицу. Вспомогательный фермент, присутствующий в смеси реагентов (β-глюкозидаза), затем действует, чтобы гидролизовать фрагмент, содержащий хромофор или флуорофор. Анализ завершается добавлением основного раствора, который останавливает ферментативную реакцию и депротонирует высвобожденное фенольное соединение с образованием фенолятов. Целлюлазная активность данного образца прямо пропорциональна количеству высвободившегося фенолята, которое можно измерить с помощью спектрофотометра. Функционализация ацеталем на невосстанавливающем конце трисахаридного субстрата предотвращает действие вспомогательной β-глюкозидазы на исходный субстрат.
Смотрите также
- Целлюлоза 1,4-бета-целлобиозидаза , эффективная целлюлаза
- Единица целлюлазы , единица для количественной оценки активности целлюлазы
Рекомендации
- ^ PDB : 1NLR ; Зульценбахер Г., Шарек Ф., Морозоли Р., Дюпон С., Дэвис Дж. Дж. (Декабрь 1997 г.). «Эндоглюканаза семейства 12 Streptomyces lividans: построение каталитического ядра, экспрессия и рентгеновская структура с разрешением 1,75 Å». Биохимия . 36 (51): 16032–9. DOI : 10.1021 / bi972407v . PMID 9440876 .; визуализировано с помощью PyMOL
- ^ Баркалов Д.Г., Уистлер Р.Л. «Целлюлоза» . AccessScience, McGraw-Hill.[ постоянная мертвая ссылка ]
- ^ Bignell DE, Roisin Y, Lo N (2011). Биология термитов: современный синтез . Дордрехт: Спрингер. ISBN 978-9048139767.
- ^ Ватанабе Х., Нода Х., Токуда Г., Ло Н. (июль 1998 г.). «Ген целлюлазы термитного происхождения». Природа . 394 (6691): 330–1. Bibcode : 1998Natur.394..330W . DOI : 10.1038 / 28527 . PMID 9690469 .
- ^ Ватанабэ Х., Токуда Г. (август 2001 г.). «Целлюлазы животных». Клеточные и молекулярные науки о жизни . 58 (9): 1167–78. DOI : 10.1007 / PL00000931 . PMID 11577976 .
- ^ a b Герриеро Дж., сержант К., Легай С. Хаусман Дж. Ф., Коши Х. М., Ахмад I, Сиддики К. С.. 2018 г. Новые выводы из сравнительного анализа in silico целлюлаз зеленых микроводорослей. Int. J. Mol. Sci. 19 (6), 1782.
- ^ Зверлов В.В., Шанц Н., Шварц WH (август 2005 г.). «Основным новым компонентом целлюлосомы Clostridium thermocellum является процессивная эндо-бета-1,4-глюканаза, продуцирующая целлотетраозу» . Письма о микробиологии FEMS . 249 (2): 353–8. DOI : 10.1016 / j.femsle.2005.06.037 . PMID 16006068 .
- ^ Пейн CM, Bomble YJ, Taylor CB, McCabe C, Himmel ME, Crowley MF, Beckham GT (ноябрь 2011 г.). «Множественные функции ароматических-углеводных взаимодействий в процессивной целлюлазе исследованы с помощью молекулярного моделирования» . Журнал биологической химии . 286 (47): 41028–35. DOI : 10.1074 / jbc.M111.297713 . PMC 3220501 . PMID 21965672 .
- ^ Ли Й.Дж., Ким Б.К., Ли Б.Х., Чо КИ, Ли Н.К., Чунг Ч. и др. (Январь 2008 г.). «Очистка и характеристика целлюлазы, продуцируемой Bacillus amyoliquefaciens DL-3 с использованием рисовой шелухи». Биоресурсные технологии . 99 (2): 378–86. DOI : 10.1016 / j.biortech.2006.12.013 . PMID 17320379 .
- ^ а б Cheng YS, Ko TP, Wu TH, Ma Y, Huang CH, Lai HL и др. (Апрель 2011 г.). «Кристаллическая структура и способ связывания субстрата целлюлазы 12A из Thermotoga maritima». Белки . 79 (4): 1193–204. DOI : 10.1002 / prot.22953 . PMID 21268113 .
- ^ Лю Ю., Йошида М., Кураката Ю., Миядзаки Т., Игараси К., Самедзима М. и др. (Март 2010 г.). «Кристаллическая структура фермента семейства 6 гликозидгидролаз, CcCel6C, целлюлазы, конститутивно продуцируемой Coprinopsis cinerea». Журнал FEBS . 277 (6): 1532–42. DOI : 10.1111 / j.1742-4658.2010.07582.x . PMID 20148970 .
- ^ Цай С.Л., ДаСильва Н.А., Чен В. (январь 2013 г.). «Функциональное отображение сложных целлюлосом на поверхности дрожжей посредством адаптивной сборки». Синтетическая биология ACS . 2 (1): 14–21. CiteSeerX 10.1.1.701.5515 . DOI : 10.1021 / sb300047u . PMID 23656322 .
- ^ Равашоль Дж., Борн Р., Тардиф К., де Филип П., Фиероб HP (март 2014 г.). «Характеристика всех гликозидгидролаз семейства 9, синтезируемых бактерией Clostridium cellulolyticum, продуцирующей целлюлосомы» . Журнал биологической химии . 289 (11): 7335–48. DOI : 10.1074 / jbc.M113.545046 . PMC 3953250 . PMID 24451379 .
- ^ Worthington Biochemical Corporation (2014), Целлюлаза . Дата доступа: 3 июля 2014 г.
- ^ Байер Е.А., Чанзи Х., Ламед Р., Шохам Й. (октябрь 1998 г.). «Целлюлоза, целлюлазы и целлюлосомы». Текущее мнение в структурной биологии . 8 (5): 548–57. DOI : 10.1016 / S0959-440X (98) 80143-7 . PMID 9818257 .
- ^ Бхаумик, Прасенджит; Дэпе, Пареш Лакшмикант (01.01.2015). «Глава 1. Преобразование биомассы в сахара» . Сахар биомассы для нетопливных применений . Серия «Зеленая химия». Королевское химическое общество. С. 1–53. DOI : 10.1039 / 9781782622079-00001 . ISBN 978-1-78262-113-3.
- ^ Флеминг Д., Рамбо КП (апрель 2017 г.). «Подходы к диспергированию медицинских биопленок» . Микроорганизмы . 5 (2): 15. doi : 10.3390 / microorganisms5020015 . PMC 5488086 . PMID 28368320 .
- ^ Флеминг Д., Чахин Л., Рамбо К. (февраль 2017 г.). «Гликозидгидролазы разлагают полимикробные бактериальные биопленки в ранах» . Противомикробные препараты и химиотерапия . 61 (2): AAC.01998–16. DOI : 10,1128 / AAC.01998-16 . PMC 5278739 . PMID 27872074 .
- ^ Джасани Х., Умретия Н., Дхараджия Д., Капурия М., Шах С., Патель Дж. (Июнь 2016 г.). «Выделение, оптимизация и производство целлюлазы Aspergillus niger из сельскохозяйственных отходов» . Журнал чистой и прикладной микробиологии . 10 (2): 1159–66.
- ^ Умезурике GM (январь 1979 г.). «Целлюлолитические ферменты Botryodiplodia theobromae Pat. Разделение и характеристика целлюлаз и бета-глюкозидаз» . Биохимический журнал . 177 (1): 9–19. DOI : 10.1042 / bj1770009 . PMC 1186335 . PMID 106849 .
- ^ Telke AA, Zhuang N, Ghatge SS, Lee SH, Ali Shah A, Khan H, et al. (2013). «Разработка гликозидгидролазы семейства 5 (Cel5A) из некультивируемых бактерий для эффективного гидролиза целлюлозных субстратов» . PLOS One . 8 (6): e65727. Bibcode : 2013PLoSO ... 865727T . DOI : 10.1371 / journal.pone.0065727 . PMC 3681849 . PMID 23785445 .
- ^ Нельсон Н. (1944). «Фотометрическая адаптация метода Somogyi для определения глюкозы». J. Biol. Chem . 153 : 375–80.
- ^ Смогый М. (март 1952 г.). «Заметки по определению сахара». Журнал биологической химии . 195 (1): 19–23. PMID 14938350 .
- ^ McCleary BV (ноябрь 1980 г.). «Новые хромогенные субстраты для анализа альфа-амилазы и (1 приводит к 4) -бета-D-глюканазе». Углеводные исследования . 86 (1): 97–104. DOI : 10.1016 / s0008-6215 (00) 84584-X . PMID 6159974 .
- ^ McCleary BV, Mangan D, Daly R, Fort S, Ivory R, McCormack N (февраль 2014 г.). «Новые субстраты для измерения эндо-1,4-β-глюканазы (эндо-целлюлазы)». Углеводные исследования . 385 : 9–17. DOI : 10.1016 / j.carres.2013.12.001 . PMID 24398300 .
- ^ Mangan D, McCleary BV, Liadova A, Ivory R, McCormack N (август 2014 г.). «Количественный флуорометрический анализ для измерения эндо-1,4-β-глюканазы». Углеводные исследования . 395 : 47–51. DOI : 10.1016 / j.carres.2014.05.002 . PMID 25038461 .
дальнейшее чтение
- Чапин Ф.С., Матсон П.А., Муни Х.А. (2002). Принципы экологии наземных экосистем (PDF) . Нью-Йорк: Спрингер. ISBN 978-0-387-95439-4. Архивировано из оригинального (PDF) 05 марта 2016 года . Проверено 4 июля 2014 .
- Руководство Мерк по диагностике и терапии, Глава 24
- Дека Д., Бхаргави П., Шарма А., Гоял Д., Джавед М., Гоял А. (2011). «Повышение активности целлюлазы из нового штамма Bacillus subtilis путем оптимизации среды и анализа с различными целлюлозными субстратами» . Ферментные исследования . 2011 : 151656. дои : 10,4061 / 2011/151656 . PMC 3102325 . PMID 21637325 .
- Зафар М., Ахмед С., Хан М.И., Джамиль А. (май 2014 г.). «Рекомбинантная экспрессия и характеристика новой эндоглюканазы из Bacillus subtilis в Escherichia coli». Отчеты по молекулярной биологии . 41 (5): 3295–302. DOI : 10.1007 / s11033-014-3192-8 . PMID 24493451 .