Иммунопреципитация
Иммунопреципитация ( ИП ) — это метод осаждения белкового антигена из раствора с использованием антител , которые специфически связываются с этим конкретным белком. Этот процесс можно использовать для выделения и концентрирования определенного белка из образца, содержащего многие тысячи различных белков. Иммунопреципитация требует, чтобы антитело было связано с твердым субстратом в какой-то момент процедуры.
Включает использование антитела, специфичного к известному белку , для выделения этого конкретного белка из раствора, содержащего множество различных белков. Эти растворы часто будут в форме неочищенного лизата растительной или животной ткани. Другими типами образцов могут быть биологические жидкости или другие образцы биологического происхождения.
Иммунопреципитация интактных белковых комплексов (т.е. антиген вместе с любыми белками или лигандами, которые с ним связаны) известна как коиммунопреципитация (Co-IP). Co-IP работает путем выбора антитела, нацеленного на известный белок, который считается членом более крупного комплекса белков. Путем нацеливания на этот известный член антитела может стать возможным извлечь весь белковый комплекс из раствора и тем самым идентифицировать неизвестные члены комплекса.
Это работает, когда белки, участвующие в комплексе, плотно связываются друг с другом, что позволяет вытащить несколько членов комплекса из раствора, зацепившись за один член с помощью антитела. Эту концепцию извлечения белковых комплексов из раствора иногда называют «вытягиванием вниз». Co-IP — это мощный метод, который регулярно используется молекулярными биологами для анализа межбелковых взаимодействий .
Иммунопреципитация хроматина (ChIP) представляет собой метод, используемый для определения местоположения сайтов связывания ДНК в геноме для конкретного интересующего белка . Этот метод дает картину взаимодействий белок-ДНК, которые происходят внутри ядра живых клеток или тканей. Природа этого метода in vivo отличается от других подходов, традиционно используемых для ответа на те же вопросы .
Принцип, лежащий в основе этого анализа, заключается в том, что ДНК-связывающие белки (включая факторы транскрипции и гистоны ) в живых клетках могут быть перекрестно связаны с ДНК, с которой они связываются. Используя антитело, специфичное к предполагаемому ДНК-связывающему белку, можно иммунопреципитировать комплекс белок-ДНК из клеточных лизатов. Сшивание часто осуществляется путем нанесения формальдегида на клетки (или ткани), хотя иногда выгодно использовать более определенный и стойкий сшивающий агент, такой как диметил-3,3'-дитиобиспропионимидат-2 HCl (DTBP) . [1] После сшивания клетки лизируются .и ДНК разбивается на части длиной 0,2–1,0 т.п.н. с помощью ультразвука . В этот момент проводится иммунопреципитация, в результате которой происходит очистка комплексов белок-ДНК. Очищенные комплексы белок-ДНК затем нагревают, чтобы обратить формальдегидную сшивку комплексов белка и ДНК, что позволяет отделить ДНК от белков. Идентичность и количество выделенных фрагментов ДНК затем можно определить с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Ограничение проведения ПЦР на выделенных фрагментах заключается в том, что необходимо иметь представление о том, какая область генома является мишенью, чтобы создать правильные праймеры для ПЦР. Иногда это ограничение можно обойти, просто клонируя выделенную геномную ДНК в плазмидный вектор .а затем с использованием праймеров, специфичных для области клонирования этого вектора. В качестве альтернативы, когда нужно найти, где белок связывается в масштабе всего генома, используется ChIP-секвенирование , которое недавно стало стандартной технологией, которая может локализовать сайты связывания белка высокопроизводительным и экономичным способом, что позволяет также для характеристики цистомы . Ранее также использовали ДНК-микрочип ( ChIP-on-chip или ChIP-chip ).
