Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Гибридизация РНК in situ - KRT5 и ген домашнего хозяйства в срезе ткани FFPE меланомы человека - визуализация под светлым полем и флуоресцентным микроскопом
Визуализация мультиплексной РНК в клетках с использованием анализов ViewRNA FISH
Гибридизация in situ эмбрионов дрозофилы дикого типа на разных стадиях развития для РНК из гена, называемого горбуном.

Гибридизация in situ (ISH) - это тип гибридизации, который использует меченую комплементарную цепь ДНК , РНК или модифицированную цепь нуклеиновых кислот (например, зонд ) для локализации определенной последовательности ДНК или РНК в части или участке ткани ( in situ ) или если ткань достаточно мала (например, семена растений,зародыши дрозофилы ), во всей ткани (цельный ISH), в клетках и в циркулирующих опухолевых клетках (ЦКО). Это отличается от иммуногистохимии , которая обычно локализует белки в срезах тканей.

Гибридизация in situ используется для выявления местоположения конкретных последовательностей нуклеиновых кислот на хромосомах или в тканях, что является решающим шагом для понимания организации, регуляции и функции генов. Ключевые методы, используемые в настоящее время, включают гибридизацию in situ с мРНК с олигонуклеотидами и зондами РНК (как радиоактивно-меченными, так и гаптен-меченными), анализ с помощью светового и электронного микроскопов, гибридизацию in situ целиком , двойное обнаружение РНК и РНК плюс белок, и флуоресцентная гибридизация in situ для обнаружения хромосомных последовательностей. ДНК ISH можно использовать для определения структуры хромосом. Флуоресцентная ДНК ISH(FISH) может, например, использоваться в медицинской диагностике для оценки целостности хромосом. РНК ISH ( гибридизация РНК in situ) используется для измерения и локализации РНК (мРНК, днРНК и миРНК) в срезах ткани, клетках, целых образцах и циркулирующих опухолевых клетках (ЦКО). Гибридизация in situ была изобретена французскими биологами Мэри-Лу Пардю и Жозефом Галлом . [1] [2] [3]

Проблемы гибридизации in-situ [ править ]

Гибридизация in situ - это мощный метод идентификации конкретных видов мРНК в отдельных клетках в срезах тканей, позволяющий получить представление о физиологических процессах и патогенезе заболеваний. Однако гибридизация in situ требует, чтобы было предпринято много шагов с точной оптимизацией для каждой исследуемой ткани и для каждого используемого зонда. Чтобы сохранить целевую мРНК в тканях, часто требуется использование сшивающих фиксаторов (таких как формальдегид ). [4]

Кроме того, гибридизация in situ на срезах ткани требует, чтобы срезы ткани были очень тонкими, обычно толщиной от 3 до 7 мкм. Общие методы подготовки тканевых срезов для обработки гибридизацией на месте включают вырезание образцов с помощью криостата или среза ткани Compresstome . Криостата требует свежей или фиксированной ткани и погружает его в жидкий азот для замораживания вспышки. Затем ткань погружают в замораживающую среду, называемую ОКТ, и вырезают тонкие срезы. Препятствия включают появление на ткани артефактов замораживания, которые могут мешать правильному окрашиванию мРНК. Compresstomeнарезает ткань тонкими ломтиками без замораживания; Свободноплавающие срезы вырезают после погружения в агарозу для стабильности. Этот метод позволяет избежать замораживания тканей и связанных с этим артефактов замораживания. После завершения этот процесс становится постоянным и необратимым. [5]

Процесс [ править ]

Для гистохимии гибридизации образцы клеток и тканей обычно обрабатывают для фиксации транскриптов-мишеней на месте и для увеличения доступа зонда. Как отмечалось выше, зонд представляет собой либо меченую комплементарную ДНК, либо, что сейчас чаще всего, комплементарную РНК ( рибозонд). Зонд гибридизуется с целевой последовательностью при повышенной температуре, а затем избыток зонда смывается (после предварительного гидролиза с использованием РНКазы в случае негибридизированного зонда с избытком РНК). Параметры раствора, такие как температура, соль и / или концентрация детергента, можно изменять для удаления любых неидентичных взаимодействий (т.е. только точные совпадения последовательности останутся связанными). Затем зонд, который был помечен радиоактивными, флуоресцентными или антиген-меченными основаниями (например, дигоксигенином ), локализуется и количественно определяется в ткани с помощью авторадиографии , флуоресцентной микроскопии или иммуногистохимии., соответственно. ISH также может использовать два или более зонда, меченных радиоактивностью или другими нерадиоактивными метками, для одновременного обнаружения двух или более транскриптов.

Альтернативная технология, анализ разветвленной ДНК , может быть использована для анализов гибридизации in situ РНК (мРНК, днРНК и миРНК) с чувствительностью отдельных молекул без использования радиоактивности. Этот подход (например, анализы ViewRNA) можно использовать для визуализации до четырех мишеней в одном анализе, и он использует запатентованную конструкцию зонда и амплификацию сигнала бДНК для генерации чувствительных и специфических сигналов. Образцы (клетки, ткани и ЦКО) фиксируются, затем обрабатываются, чтобы обеспечить доступность РНК-мишени (немаскирование РНК). Зонды, специфичные для мишени, гибридизуются с каждой целевой РНК. Последующее усиление сигнала основано на специфической гибридизации соседних зондов (отдельных олигонуклеотидов[олигонуклеотидов], которые связываются бок о бок с мишенями РНК). Типичный зонд, специфичный для мишени, будет содержать 40 олигонуклеотидов, в результате чего образуются 20 пар олигонуклеотидов, которые параллельно связываются на мишени для обнаружения мРНК и днРНК, и 2 олигонуклеотида или одна пара для обнаружения миРНК. Усиление сигнала достигается с помощью серии последовательных шагов гибридизации. Молекула предварительного усилителя гибридизуется с каждой олигопарой на целевой РНК, затем несколько молекул усилителя гибридизуются с каждым предварительным усилителем. Затем олигонуклеотиды с множественными метками зонда (конъюгированные с щелочной фосфатазой или непосредственно с флуорофорами) гибридизуются с каждой молекулой усилителя. Полностью собранная структура амплификации сигнала «Дерево» имеет 400 сайтов связывания для зондов-меток. Когда все специфичные для мишени зонды связываются с транскриптом мРНК-мишени, число 8,Для этого одного транскрипта происходит 000-кратное усиление сигнала. Отдельные, но совместимые системы усиления сигнала позволяют проводить мультиплексные анализы. Сигнал можно визуализировать с помощью флуоресцентного или светлопольного микроскопа.

Основные шаги для зондов, меченных дигоксигенином [ править ]

  1. проницаемость клеток протеиназой К до открытых клеточных мембран (около 25 минут, не требуется для срезов тканей или некоторых эмбрионов на ранних стадиях)
  2. связывание мРНК с меченым РНК-зондом (обычно в течение ночи)
  3. Связывание антитело-фосфатаза с РНК-зондом (несколько часов)
  4. окрашивание антител (например, щелочной фосфатазой )

Протокол занимает около 2–3 дней и требует времени на настройку. Некоторые компании продают роботов для автоматизации процесса (например, Intavis InsituPro VSi ). В результате в лабораториях были проведены широкомасштабные исследования тысяч генов. К результатам обычно можно получить доступ через веб-сайты (см. Внешние ссылки). [6]

См. Также [ править ]

  • Хромогенная гибридизация in situ (CISH)
  • Флуоресцентная гибридизация in situ

Ссылки [ править ]

  1. ^ О'Коннор, Клэр. «Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)» . Природное образование.
  2. ^ Галл, JG ; Пардью, ML (июнь 1969). «Образование и обнаружение гибридных молекул РНК-ДНК в цитологических препаратах» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 63 (2): 378–83. Bibcode : 1969PNAS ... 63..378G . DOI : 10.1073 / pnas.63.2.378 . PMC 223575 . PMID 4895535 .  
  3. ↑ Галл, Джо . «Премия Альберта Ласкера за особые достижения в области медицины» . Фонд Ласкера.
  4. ^ Леманн, Рут; Тауц, Дитхард (1994-01-01), Гольдштейн, Лоуренс С.Б. Fyrberg, Эрик А. (ред.), "Глава 30 В гибридизация РНК" , методы в клеточной биологии , Academic Press, 44 , стр 575-598,. Дои : 10.1016 / s0091-679x (08) 60933-4 , получено 2021-02-21
  5. ^ Браун, Линдси А .; Охотник, Дэвид (2007-05-01). «Флуоресцентная гибридизация in situ на тканевых микроматрицах: проблемы и решения» . Журнал молекулярной гистологии . 38 (2): 151–157. DOI : 10.1007 / s10735-006-9069-у . ISSN 1567-2387 . 
  6. ^ Паноскальцис-Мортари, А .; Бьюси, РП (февраль 1995 г.). «Гибридизация in situ с РНК-зондами, меченными дигоксигенином: факты и артефакты» . Биотехнологии . 18 (2): 300–307. ISSN 0736-6205 . PMID 7727134 .  
  1. Джин, Л; Ллойд, Р.В. (1997). «Гибридизация in situ: методы и приложения» . Журнал клинического лабораторного анализа . 11 (1): 2–9. DOI : 10.1002 / (SICI) 1098-2825 (1997) 11: 1 <2 :: AID-JCLA2> 3.0.CO; 2-F . PMC  6760707 . PMID  9021518 .
  2. Комплексная и аннотированная гистохимия гибридизации in situ
  3. Секвенирование РНК циркулирующих опухолевых клеток поджелудочной железы предполагает участие передачи сигналов WNT в метастазировании
  4. Локальный транскриптом в синаптическом нейропиле, выявленный с помощью глубокого секвенирования и визуализации с высоким разрешением

Внешние ссылки [ править ]

  • In +itu + Hybridization в Национальной медицинской библиотеке США по медицинским предметным рубрикам (MeSH)
  • Гибридизация in situ зондов РНК и miRNA с клетками, ЦКО и тканями
  • Полная гибридизация in situ РНК-зондов с тканями растений
  • Подготовка наборов сложных ДНК-зондов для 3D FISH с использованием до шести различных флуорохромов
  • Транскриптная гибридизация целых зародышей in situ для анализа фенотипа дрозофилы, обработанной РНКи
  • in-situ базы данных:
    • Призрак, факторы транскрипции C.
    • Экспрессия гена рыбок данио
    • Экспрессия гена MGI GXD мыши
    • eurexpress