Анализ значения Phi

Анализ значения Phi , анализ или анализ -значения - это метод экспериментальной белковой инженерии для изучения структуры переходного состояния сворачивания небольших белковых доменов, которые сворачиваются в двухуровневом режиме. Структуру переходного состояния сворачивания трудно найти с помощью таких методов, как ЯМР белков или рентгеновской кристаллографии, потому что переходные состояния сворачивания являются мобильными и частично неструктурированными по определению. В -Value анализа, складывающаяся кинетика и конформационная стабильность складывания дикого типа белка по сравнению с таковыми из ${\ displaystyle \ phi}$ ${\ displaystyle \ phi}$ ${\ displaystyle \ phi}$ точечные мутанты, чтобы найти значения phi . Они измеряют энергетический вклад мутантного остатка в переходное состояние сворачивания, которое выявляет степень нативной структуры вокруг мутантного остатка в переходном состоянии, принимая во внимание относительную свободную энергию развернутого состояния, свернутого состояния и переходного состояния для белки дикого типа и мутантные белки.

Остатки белка мутируют один за другим, чтобы идентифицировать кластеры остатков, которые хорошо упорядочены в свернутом переходном состоянии. Взаимодействие этих остатков можно проверить с помощью анализа двойного мутантного цикла ${\ displaystyle \ phi}$ , в котором эффекты односайтовых мутантов сравнивают с эффектами двойных мутантов. Большинство мутаций являются консервативными и заменить исходный остаток с меньшим одной ( мутациями полости, создавая ) , как аланин , хотя тирозин -До- фенилаланин , изолейцин -До- валин и треонин -До- серин мутанты могут быть использованы также. Химотрипсин ингибитор, SH3 домены отдельные домены белков L и G, убиквитина и барназы были изучены с помощью анализа. ${\ displaystyle \ phi}$

Математический подход [ править ]

Диаграммы энергии для = 0 (слева) или 1 (справа). D - это энергия денатурированного состояния, кинжала - переходного состояния, а N - исходного состояния.

{\ displaystyle \ phi}

Фи определяется следующим образом: ^[1]

\phi ={\frac {(\Delta G_{W}^{TS\rightarrow D}-\Delta G_{M}^{TS\rightarrow D})}{(\Delta G_{W}^{N\rightarrow D}-\Delta G_{M}^{N\rightarrow D})}}={\frac {\Delta \Delta G^{TS\rightarrow D}}{\Delta \Delta G^{N\rightarrow D}}}

$\Delta G_{W}^{TS\rightarrow D}$ - это разница в энергии между переходным и денатурированным состояниями белка дикого типа , - это такая же разница в энергии, но для мутантного белка, а биты - это различия в энергии между нативным и денатурированным состояниями. Значение phi интерпретируется как то, насколько мутация дестабилизирует переходное состояние по сравнению со свернутым состоянием. $\Delta G_{M}^{TS\rightarrow D}$ $\Delta G^{N\rightarrow D}$

Хотя, возможно, предполагалось, что он находится в диапазоне от нуля до единицы, могут появляться отрицательные значения. ^[2] Значение нуля предполагает, что мутация не влияет на структуру ограничивающего скорость переходного состояния пути сворачивания, а значение единицы предполагает, что мутация дестабилизирует переходное состояние в такой же степени, как и состояние свертывания; значения, близкие к нулю, предполагают, что область вокруг мутации относительно развернута или неструктурирована в переходном состоянии, а значения, близкие к единице, предполагают, что локальная структура переходного состояния рядом с сайтом мутации подобна структуре нативного состояния. Консервативные замены на поверхности белка часто дают значения phi, близкие к единице. Когда находится между нулем и единицей, это менее информативно, поскольку не говорит нам, что именно: $\phi$ $\phi$

Само переходное состояние частично структурировано; или же
Есть две белковые популяции с примерно равным количеством белков , одна из которых в основном развернута, а другая - в основном свернуты.

Ключевые предположения [ править ]

Анализ значения Phi предполагает постулат Хаммонда , который утверждает, что энергия и химическая структура взаимосвязаны. Хотя взаимосвязь между структурами складывающегося промежуточного и естественного состояния может коррелировать между их энергиями, когда энергетический ландшафт имеет четко определенный, глубокий глобальный минимум, дестабилизация свободной энергии может не дать полезной структурной информации, когда энергетический ландшафт более плоский или имеет много локальных минимумы.
Анализ значения Phi предполагает, что путь сворачивания существенно не изменяется, хотя энергии сворачивания могут быть. Поскольку неконсервативные мутации могут не подтвердить это, предпочтительны консервативные замены, хотя они могут давать меньшую энергетическую дестабилизацию, которую труднее обнаружить.
Ограничение числами больше нуля - это то же самое, что предположение, что мутация увеличивает стабильность и снижает энергию ни нативного, ни переходного состояния. В той же линии предполагается, что взаимодействия, которые стабилизируют переходное состояние сворачивания, подобны взаимодействиям с нативной структурой, хотя некоторые исследования сворачивания белков показали, что стабилизация ненативных взаимодействий в переходном состоянии облегчает укладку. ^[3] $\phi$

Пример: barnase [ править ]

Алан Фершт впервые применил анализ значения phi в своем исследовании небольшой бактериальной протеин- барназы . ^[4]^[5] Используя моделирование молекулярной динамики , он обнаружил, что переходное состояние между сворачиванием и разворачиванием выглядит как естественное состояние и одинаково независимо от направления реакции. Phi варьировался в зависимости от местоположения мутации, поскольку некоторые области давали значения, близкие к нулю, а другие - к единице. Распределение $\phi$ значения во всей последовательности белка согласовывались со всем смоделированным переходным состоянием, кроме одной спирали, которая складывалась полунезависимо и создавала нативные контакты с остальной частью белка только после того, как переходное состояние сформировалось полностью. Такое изменение скорости сворачивания в одном белке затрудняет интерпретацию значений, поскольку структура переходного состояния в противном случае должна сравниваться с симуляциями сворачивания-разворачивания, которые требуют больших вычислительных ресурсов. $\phi$

Варианты [ править ]

В последнее время появились и другие методы «кинетического возмущения» для изучения переходного состояния сворачивания. Наиболее известным является значение psi ( ) ^[6]^[7], которое определяется путем преобразования двух металлсвязывающих аминокислотных остатков, таких как гистидин, в белок и последующей регистрации кинетики сворачивания в зависимости от концентрации иона металла, ^[8] хотя Фершт считал такой подход трудным. ^[9] « Сшивающий » вариант значения -значения был использован для изучения ассоциации сегментов в переходном состоянии сворачивания, поскольку были введены ковалентные сшивки, такие как дисульфидные связи . ^[10] $\psi$ $\phi$

Ограничения [ править ]

Ошибка в измерениях равновесной стабильности и скорости водного (не) фолдинга может быть большой, когда значения для растворов с денатурантами должны быть экстраполированы на почти чистые водные растворы или разница в стабильности между нативным и мутантным белком «низкая» или менее чем 7 кДж / моль. Это может привести к выходу за пределы диапазона нуля или единицы. ^[11] Расчетные значения сильно зависят от количества доступных точек данных и лабораторных условий. ^[12] $\phi$ $\phi$ $\phi$

См. Также [ править ]

Шеврон сюжет
Средняя точка денатурации
Равновесие разворачивается

Ссылки [ править ]

^ Даггетт V , Fersht АР. (2000). Переходные состояния в сворачивании белков. В « Механизмы сворачивания белков», 2-е изд., Редактор RH Pain. Издательство Оксфордского университета.
^ Риос, Массачусетс; Данеши, М; Plaxco, KW (2005). «Экспериментальное исследование частоты и зависимости замещений отрицательных значений phi в белках с двумя состояниями». Биохимия . 44 (36): 12160–7. DOI : 10.1021 / bi0505621 . PMID 16142914 .
^ Zarrine-Asfar, Arash; Валлин, Стефан (22 июля 2008 г.). «Теоретическая и экспериментальная демонстрация важности специфических взаимодействий, не связанных с природой, в сворачивании белков» (PDF) . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . Естественная академия наук. 105 (29): 9999–10004. DOI : 10.1073 / pnas.0801874105 . PMC 2481363 . PMID 18626019 .
^ Матушек, А; Келлис, JT; Серрано, L; Фершт, АР (1989). «Картирование переходного состояния и пути сворачивания белка с помощью белковой инженерии». Природа . 340 (6229): 122–6. DOI : 10.1038 / 340122a0 . PMID 2739734 .
^ Fersht, AR; Матушек, А; Серрано, Л. (1992). «Сворачивание фермента I. Теория белковой инженерии, анализ стабильности и пути сворачивания белка». J Mol Biol . 224 (3): 771–82. DOI : 10.1016 / 0022-2836 (92) 90561-W . PMID 1569556 .
^ Сосник, TR; Дотагер, RS; Кранц, BA (2004). «Различия в складчатом переходном состоянии убиквитина, показанные и анализы» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 101 (50): 17377–17382. DOI : 10.1073 / pnas.0407683101 . PMC 536030 . PMID 15576508 . ϕ {\displaystyle \phi } ψ {\displaystyle \psi }
^ Кранц, BA; Дотагер, RS; Сосник, Т.Р. (март 2004 г.). «Распознавание структуры и энергии множественных переходных состояний в сворачивании белков с использованием -анализа». J. Mol. Биол . 337 : 463–75. DOI : 10.1016 / j.jmb.2004.01.018 . PMID 15003460 . $\psi$
^ Кранц, BA; Сосник, Т.Р. (2001). «Спроектированные участки связывания металла отображают неоднородный ландшафт складчатости намотанной катушки». Nat. Struct. Биол . 8 (12): 1042–1047. DOI : 10.1038 / nsb723 . PMID 11694889 .
^ Fersht, AR (2004). « ценность против анализа» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 101 (50): 17327–17328. DOI : 10.1073 / pnas.0407863101 . PMC 536033 . PMID 15583125 . Φ {\displaystyle \Phi } ψ {\displaystyle \psi }
^ Ведемейер, WJ; Велкер, Э; Нараян, М; Scheraga, HA (июнь 2000 г.). «Дисульфидные связи и сворачивание белков» . Биохимия . 39 (23): 7032. DOI : 10.1021 / bi005111p . PMID 10841785 .
^ Санчес, IE; Кифхабер, Т. (2003). «Происхождение необычных phi-значений в сворачивании белка: свидетельства против конкретных сайтов нуклеации». J. Mol. Биол . 334 (5): 1077–1085. DOI : 10.1016 / j.jmb.2003.10.016 . PMID 14643667 .
^ Мигель; Лос-Риос, А. Де; Muraidhara, BK; Уайлдс, Дэвид; Sosnick, Tobin R .; Маркиз, Сьюзен; Виттунг-Стафшеде, Пернилла; Plaxco, Кевин У .; Ручинский, Инго (2006). «О точности экспериментально определенных скоростей сворачивания белков и phi-значений» . Белковая наука . 15 (3): 553–563. DOI : 10.1110 / ps.051870506 . PMC 2249776 . PMID 16501226 .

[Daggett-1] Даггетт V , Fersht АР. (2000). Переходные состояния в сворачивании белков. В « Механизмы сворачивания белков», 2-е изд., Редактор RH Pain. Издательство Оксфордского университета.

[2] Риос, Массачусетс; Данеши, М; Plaxco, KW (2005). «Экспериментальное исследование частоты и зависимости замещений отрицательных значений phi в белках с двумя состояниями». Биохимия . 44 (36): 12160–7. DOI : 10.1021 / bi0505621 . PMID 16142914 .

[3] Zarrine-Asfar, Arash; Валлин, Стефан (22 июля 2008 г.). «Теоретическая и экспериментальная демонстрация важности специфических взаимодействий, не связанных с природой, в сворачивании белков» (PDF) . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . Естественная академия наук. 105 (29): 9999–10004. DOI : 10.1073 / pnas.0801874105 . PMC 2481363 . PMID 18626019 .

[4] Матушек, А; Келлис, JT; Серрано, L; Фершт, АР (1989). «Картирование переходного состояния и пути сворачивания белка с помощью белковой инженерии». Природа . 340 (6229): 122–6. DOI : 10.1038 / 340122a0 . PMID 2739734 .

[5] Fersht, AR; Матушек, А; Серрано, Л. (1992). «Сворачивание фермента I. Теория белковой инженерии, анализ стабильности и пути сворачивания белка». J Mol Biol . 224 (3): 771–82. DOI : 10.1016 / 0022-2836 (92) 90561-W . PMID 1569556 .

[6] Сосник, TR; Дотагер, RS; Кранц, BA (2004). «Различия в складчатом переходном состоянии убиквитина, показанные и анализы» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 101 (50): 17377–17382. DOI : 10.1073 / pnas.0407683101 . PMC 536030 . PMID 15576508 . ϕ {\displaystyle \phi } ψ {\displaystyle \psi }

[7] Кранц, BA; Дотагер, RS; Сосник, Т.Р. (март 2004 г.). «Распознавание структуры и энергии множественных переходных состояний в сворачивании белков с использованием -анализа». J. Mol. Биол . 337 : 463–75. DOI : 10.1016 / j.jmb.2004.01.018 . PMID 15003460 . $\psi$

[8] Кранц, BA; Сосник, Т.Р. (2001). «Спроектированные участки связывания металла отображают неоднородный ландшафт складчатости намотанной катушки». Nat. Struct. Биол . 8 (12): 1042–1047. DOI : 10.1038 / nsb723 . PMID 11694889 .

[9] Fersht, AR (2004). « ценность против анализа» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 101 (50): 17327–17328. DOI : 10.1073 / pnas.0407863101 . PMC 536033 . PMID 15583125 . Φ {\displaystyle \Phi } ψ {\displaystyle \psi }

[10] Ведемейер, WJ; Велкер, Э; Нараян, М; Scheraga, HA (июнь 2000 г.). «Дисульфидные связи и сворачивание белков» . Биохимия . 39 (23): 7032. DOI : 10.1021 / bi005111p . PMID 10841785 .

[11] Санчес, IE; Кифхабер, Т. (2003). «Происхождение необычных phi-значений в сворачивании белка: свидетельства против конкретных сайтов нуклеации». J. Mol. Биол . 334 (5): 1077–1085. DOI : 10.1016 / j.jmb.2003.10.016 . PMID 14643667 .

[12] Мигель; Лос-Риос, А. Де; Muraidhara, BK; Уайлдс, Дэвид; Sosnick, Tobin R .; Маркиз, Сьюзен; Виттунг-Стафшеде, Пернилла; Plaxco, Кевин У .; Ручинский, Инго (2006). «О точности экспериментально определенных скоростей сворачивания белков и phi-значений» . Белковая наука . 15 (3): 553–563. DOI : 10.1110 / ps.051870506 . PMC 2249776 . PMID 16501226 .