Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
механизм сплайсинга белков с участием интеинов
Механизм сплайсинга белков с участием интеинов. На этой схеме N-extein показан красным, интеин - черным, а C-extein - синим. X представляет собой атом кислорода или серы.

Сплайсинг белков - это внутримолекулярная реакция определенного белка, в которой внутренний белковый сегмент (называемый интеином ) удаляется из белка-предшественника с лигированием C-концевых и N-концевых внешних белков (называемых экстеинами ) с обеих сторон. Соединение сплайсинга белка-предшественника в основном представляет собой цистеин или серин , которые представляют собой аминокислоты, содержащие нуклеофильную боковую цепь . Известные в настоящее время реакции сплайсинга белков не требуют экзогенных кофакторов или источников энергии, таких как аденозинтрифосфат (АТФ) илигуанозинтрифосфат (ГТФ). Обычно сплайсинг связан только со сплайсингом пре-мРНК . Этот белок-предшественник содержит три сегмента - N-экстеин, за которым следует интеин, за которым следует C-экстеин . После сплайсинга полученный белок содержит N-extein, связанный с C-extein; этот сращивающий продукт также называют экстейном.

История [ править ]

Первый интеин был открыт в 1988 году путем сравнения последовательностей между вакуолярной АТФазой Neurospora crassa [1] и моркови [2] (без интеина) и гомологичным геном дрожжей (с интеином), который был впервые описан как предполагаемый переносчик ионов кальция . [3] В 1990 г. Хирата и др. [4] продемонстрировали, что дополнительная последовательность в гене дрожжей транскрибируется в мРНК и удаляется из белка-хозяина только после трансляции. С тех пор интеины были обнаружены во всех трех сферах жизни (эукариоты, бактерии и археи) и в вирусах .

Сплайсинг белков был неожиданным, и его механизмы были обнаружены двумя группами (Anraku [5] и Stevens [6] ) в 1990 году. Они обе обнаружили Saccharomyces cerevisiae VMA1 в предшественнике вакуолярного фермента H + - ATPase . Аминокислотная последовательность N- и C-концов соответствовала 70% последовательности ДНК вакуолярной Н + -АТФазы других организмов, в то время как аминокислотная последовательность центрального положения соответствовала 30% общей последовательности ДНК дрожжи HO нуклеазы .

Многие гены имеют неродственные кодирующие интеин сегменты, вставленные в разные положения. По этим и другим причинам интеины (или, точнее, сегменты гена, кодирующие интеины) иногда называют эгоистичными генетическими элементами , но, возможно, правильнее будет назвать их паразитическими . Согласно геноцентричному взгляду на эволюцию, большинство генов «эгоистичны» лишь постольку, поскольку они конкурируют с другими генами или аллелями, но обычно они выполняют функцию для организмов, тогда как «паразитические генетические элементы», по крайней мере на начальном этапе, не создают положительный вклад в физическую форму организма. [7] [8]

В базе данных всех известных интеинов ( [1] ) 113 известных интеинов присутствуют в эукариотах с минимальной длиной 138 аминокислот и максимальной длиной 844 аминокислоты. Первый интеин был обнаружен в гене VMA Saccharomyces cerevisiae . Позже они были обнаружены в грибах (аскомицеты, базидиомицеты, зигомицеты и хитриды), а также в различных белках. Было описано, что белок, отдаленно связанный с известными интеинами, содержащими белок, но тесно связанный с белками многоклеточных животных hedgehog , имеет последовательность интеина из Glomeromycota. Многие из недавно описанных интеинов содержат самонаводящиеся эндонуклеазы, и некоторые из них, по-видимому, активны. [9] Обилие интеина в грибах указывает на боковой перенос.интеин-содержащих генов. У эубактерий и архей в настоящее время известно 289 и 182 интеина. Неудивительно, что большая часть интеина у эубактерий и архей, как и у грибов, встроена в метаболический белок нуклеиновых кислот. [9]

Механизм [ править ]

Процесс начинается со сдвига NO или NS, когда боковая цепь первого остатка ( серин , треонин или цистеин ) интеиновой части белка-предшественника нуклеофильно атакует пептидную связь остатка непосредственно перед ним (то есть конечный остаток N-extein) с образованием промежуточного линейного сложного эфира (или сложного тиоэфира ). Переэтерификации происходит тогда , когда боковая цепь первого остатка атак C-extein вновь образованной (тио) эфира , чтобы освободить N-терминалконец интеина. Это образует разветвленный интермедиат, в котором N-extein и C-extein присоединены, хотя и не через пептидную связь. Последний остаток интеина всегда представляет собой аспарагин , а атом азота амида этой боковой цепи расщепляет пептидную связь между интеином и С-экстеином, в результате чего образуется свободный сегмент интеина с концевым циклическим имидом . Наконец, свободная аминогруппа C-extein теперь атакует (тио) сложный эфир, связывая N- и C-экстеины вместе. Сдвиг ON или SN приводит к образованию пептидной связи и функционального лигированного белка. [10]

Механизм эффекта сплайсинга является естественной аналогией метода химического создания белков среднего размера, называемого нативным химическим лигированием .

Интеин [ править ]

Интеин представляет собой сегмент белка , который способен вырезань себя и присоединиться к оставшимся частям (в exteins ) с пептидной связью в ходе белкового сплайсинга. [11] Интеины также называют интронами белков по аналогии с интронами (РНК) .

Соглашения об именах [ править ]

Первая часть имени интеина основана на научном название этого организма , в котором она находится, а вторая часть основана на имя соответствующего гена или extein. Например, интеин, обнаруженный в Thermoplasma acidophilum и связанный с субъединицей A вакуолярной АТФазы (VMA), называется «Tac VMA».

Обычно, как в этом примере, достаточно всего трех букв, чтобы указать организм, но есть варианты. Например, для обозначения напряжения могут быть добавлены дополнительные буквы. Если в соответствующем гене кодируется более одного интеина, интеинам дается числовой суффикс, начиная с 5 'до 3' или в порядке их идентификации (например, «Msm dnaB-1»).

Сегменту гена, который кодирует интеин, обычно дается то же имя, что и интеин, но во избежание путаницы имя собственно интеина обычно пишется с большой буквы ( например , Pfu RIR1-1), тогда как имя соответствующего сегмента гена курсивом ( например , Pfu rir1-1 ).

Типы интеинов [ править ]

Типы белков сплайсинга подразделяются на четыре класса: макси-интеин, мини-интеин, интеин транс-сплайсинга и интеин аланина . Макси-интеины представляют собой N- и C-концевые домены сплайсинга, содержащие эндонуклеазный домен. Мини-интеины представляют собой типичные N- и C-концевые домены сплайсинга; однако эндонуклеазный домен отсутствует. При транс-сплайсинге интеинов интеин расщепляется на два (или, возможно, более) домена, которые затем делятся на N-конец и C-конец. Интеины аланина имеют сплайсинговое соединение аланина вместо цистеина или серина, в обоих из которых происходит сплайсинг белка.

Полные и мини-интерфейсы [ править ]

Интеины могут содержать домен самонаводящегося гена эндонуклеазы (HEG) в дополнение к доменам сплайсинга. Этот домен отвечает за распространение интеина путем расщепления ДНК на свободном от интеина аллеле на гомологичной хромосоме , запуская систему репарации двухцепочечных разрывов ДНК (DSBR), которая затем восстанавливает разрыв, тем самым копируя ДНК, кодирующую интеин. на сайт, ранее не содержавший интеина. Домен HEG не является необходимым для интеина сплайсинга, и поэтому он может быть потерян, образуя минимальную или мини , интеин . Несколько исследований продемонстрировали модульную природу интеинов путем добавления или удаления доменов HEG и определения активности новой конструкции. [цитата необходима ]

Разделить интеины [ править ]

Иногда интеин белка-предшественника происходит от двух генов. В этом случае интеин называется расщепленным интеином . Например, в цианобактерии , DnaE , каталитическая субъединица α из ДНК - полимеразы III , кодируется двумя отдельными генами, dnaE-н и dnaE-с . DnaE-н продукт состоит из N-extein последовательности с последующим 123-AA интеина последовательности, в то время как dnaE-с Продукт состоит из 36-AA интеина последовательности с последующим C-extein последовательности. [12]

Приложения в биотехнологии [ править ]

Интеины очень эффективны при сплайсинге белков, и, соответственно, они нашли важную роль в биотехнологии . На сегодняшний день идентифицировано более 200 интеинов; размеры варьируются от 100 до 800 AA . Интеины были разработаны для конкретных применений, таких как полусинтез белков [13] и селективное мечение белковых сегментов, что полезно для ЯМР- исследований больших белков. [14]

Фармацевтическое ингибирование удаления интеина может быть полезным инструментом для разработки лекарств ; белок, содержащий интеин, не будет выполнять свою нормальную функцию, если интеин не вырезан, так как его структура будет нарушена.

Было высказано предположение, что интеины могут оказаться полезными для достижения аллотопной экспрессии некоторых высокогидрофобных белков, обычно кодируемых митохондриальным геномом, например, в генной терапии . [15] Гидрофобность этих белков препятствует их импорту в митохондрии. Следовательно, вставка негидрофобного интеина может позволить этому импорту продолжаться. Вырезание интеина после импорта затем восстановит белок до дикого типа .

Аффинные метки широко используются для очистки рекомбинантных белков, поскольку они позволяют накапливать рекомбинантный белок с небольшим количеством примесей. Однако аффинный тег должен быть удален протеазами на последней стадии очистки. Этап дополнительного протеолиза поднимает проблемы специфичности протеазы при удалении аффинных меток из рекомбинантного белка и удалении продукта переваривания. Этой проблемы можно избежать путем слияния аффинной метки с саморасщепляемыми интеинами в контролируемой среде. В первом поколении экспрессионных векторов такого типа использовался модифицированный интеин Saccharomyces cerevisiae VMA (Sce VMA). Чонг и др. [16] использовали хитинсвязывающий домен (CBD) из Bacillus circus.как тег сходства и объединил этот тег с измененным intein Sce VMA. Модифицированный интеин подвергается реакции самоотщепления по своей N-концевой пептидной связи с 1,4-дитиотреитолом (DTT), β-меркаптоэтанолом (β-ME) или цистином при низких температурах в широком диапазоне pH. После экспрессии рекомбинантного белка гомогенат клетки пропускают через колонку, содержащую хитин.. Это позволяет CBD химерного белка связываться с колонкой. Кроме того, когда температура понижается и описанные выше молекулы проходят через колонку, химерный белок подвергается самосплайсингу, и элюируется только целевой белок. Этот новый метод устраняет необходимость в стадии протеолиза, и модифицированный Sce VMA остается в колонке, прикрепленной к хитину через CBD. [16]

Недавно интеины были использованы для очистки белков на основе самоагрегированных пептидов. Эластиноподобные полипептиды (ELP) - полезный инструмент в биотехнологии. Слитые с белком-мишенью, они имеют тенденцию образовывать агрегаты внутри клеток. [17] Это исключает необходимость хроматографической очистки белка. Теги ELP были использованы в слитом белке интеина, так что агрегаты могут быть выделены без хроматографии (центрифугированием), а затем интеин и метка могут быть расщеплены контролируемым образом для высвобождения целевого белка в раствор. Это выделение белка может быть выполнено с использованием непрерывного потока среды, что дает большое количество белка, что делает этот процесс более экономически эффективным, чем обычные методы. [17]Другая группа исследователей использовала более мелкие самоагрегированные метки для выделения целевого белка. Небольшие амфипатические пептиды 18A и ELK16 (фиг. 5) использовали для образования саморасщепляющегося агрегирующего белка. [18]

См. Также [ править ]

  • Внутригеномный конфликт
  • Интрон
  • Белковая метка
  • Сплайсинг РНК

Ссылки [ править ]

  1. ^ Bowman, EJ; Тенни, К; Боуман, Би Джей (октябрь 1988 г.). «Выделение генов, кодирующих вакуолярную АТФазу Neurospora. Анализ vma-1, кодирующего субъединицу 67 кДа, выявляет гомологию с другими АТФазами». J Biol Chem . 263 (28): 13994–4001. PMID  2971651 .
  2. ^ Зимняк, L; Dittrich, P; Gogarten, JP; Кибак, Н; Taiz, L (июль 1988 г.). «Последовательность кДНК 69-кДа субъединицы вакуолярной Н + -АТФазы моркови. Гомология бета-цепи F0F1-АТФаз». J Biol Chem . 263 (19): 9102–12. PMID 2897965 . 
  3. ^ Ши, СК; Вагнер, Р; Файнштейн, S; Каник-Эннулат, Ц; Нефф, Н. (август 1988 г.). «Доминантный ген устойчивости к трифлуоперазину из Saccharomyces cerevisiae имеет гомологию с АТФ-синтазой F0F1 и обеспечивает чувствительный к кальцию рост» . Mol Cell Biol . 8 (8): 3094–103. DOI : 10.1128 / mcb.8.8.3094 . PMC 363536 . PMID 2905423 .  
  4. ^ Хирата, R; Осумк, Й; Накано, А; Кавасаки, H; Сузуки, К; Anraku, Y (апрель 1990 г.). «Молекулярная структура гена VMA1, кодирующего каталитическую субъединицу H (+) - транслокации аденозинтрифосфатазы из вакуолярных мембран Saccharomyces cerevisiae». J Biol Chem . 265 (12): 6726–33. PMID 2139027 . 
  5. ^ Хирата R, Ohsumk Y, Накано А, Кавасаки Н, Suzuki К, Anraku Y (апрель 1990 г.). «Молекулярная структура гена VMA1, кодирующего каталитическую субъединицу H (+) - транслокации аденозинтрифосфатазы из вакуолярных мембран Saccharomyces cerevisiae». J. Biol. Chem . 265 (12): 6726–33. PMID 2139027 . 
  6. ^ Кейн ПМ, Ямаширо КТ, Wolczyk DF, Neff N, Goebl М, Стивенс TH (ноябрь 1990). «Белковый сплайсинг превращает дрожжевой продукт гена TFP1 в 69-кДа субъединицу вакуолярной H (+) - аденозинтрифосфатазы». Наука . 250 (4981): 651–7. Bibcode : 1990Sci ... 250..651K . DOI : 10.1126 / science.2146742 . PMID 2146742 . 
  7. ^ Swithers, Кристен S .; Soucy, Shannon M .; Гогартен, Дж. Питер (2012). «Роль ретикулярной эволюции в создании инноваций и сложности» . Международный журнал эволюционной биологии . 2012 : 1–10. DOI : 10.1155 / 2012/418964 . ISSN 2090-8032 . PMC 3403396 . PMID 22844638 .   
  8. ^ Докинз, Ричард (1976). Эгоистичный ген . Издательство Оксфордского университета.
  9. ^ а б Perler, FB (2002). «InBase: база данных Intein» . Исследования нуклеиновых кислот . 30 (1): 383–384. DOI : 10.1093 / NAR / 30.1.383 . ISSN 1362-4962 . PMC 99080 . PMID 11752343 .   
  10. ^ Норен CJ, Ван - J, Perler FB (2000). «Анализ химии белкового сплайсинга и его приложений». Angew Chem Int Ed Engl . 39 (3): 450–66. DOI : 10.1002 / (sici) 1521-3773 (20000204) 39: 3 <450 :: aid-anie450> 3.3.co; 2-6 . PMID 10671234 . 
  11. ^ Анраку, Y; Mizutani, R; Сатов, Y (2005). «Сплайсинг белков: его открытие и структурное понимание новых химических механизмов» . IUBMB Life . 57 (8): 563–74. DOI : 10.1080 / 15216540500215499 . PMID 16118114 . 
  12. ^ Wu, H .; Hu, Z .; Лю, XQ (1998). «Транс-сплайсинг белка с помощью расщепленного интеина, кодируемого расщепленным геном DnaE Synechocystis sp. PCC6803» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 95 (16): 9226–9231. Bibcode : 1998PNAS ... 95.9226W . DOI : 10.1073 / pnas.95.16.9226 . PMC 21320 . PMID 9689062 .  
  13. Перейти ↑ Schwarzer D, Cole PA (2005). «Полусинтез белков и выраженное лигирование белков: погоня за хвостом белка». Curr Opin Chem Biol . 9 (6): 561–9. DOI : 10.1016 / j.cbpa.2005.09.018 . PMID 16226484 . 
  14. ^ Muralidharan V, Muir TW (2006). «Белковое лигирование: эффективная технология для биофизического анализа белков». Nat. Методы . 3 (6): 429–38. DOI : 10.1038 / nmeth886 . PMID 16721376 . S2CID 12550693 .  
  15. ^ де Грей, Обри DNJ (2000). «Митохондриальная генная терапия: арена для биомедицинского использования интеинов». Тенденции в биотехнологии . 18 (9): 394–399. DOI : 10.1016 / S0167-7799 (00) 01476-1 . ISSN 0167-7799 . PMID 10942964 .  
  16. ^ а б Чонг, Шаоронг; Мерша, Фана Б; Расческа, Donald G; Скотт, Мелисса Э; Лэндри, Дэвид; Ванс, Луис М; Перлер, Франсин Б. Беннер, Джек; Кучера, Ребекка Б.; Хирвонен, Кристина А; Пеллетье, Джон Дж; Паулюс, Генри; Сюй, Мин-Цюнь (1997). «Очистка свободных рекомбинантных белков на одной колонке с использованием саморасщепляемой аффинной метки, полученной из элемента сплайсинга белка». Джин . 192 (2): 271–281. DOI : 10.1016 / S0378-1119 (97) 00105-4 . ISSN 0378-1119 . PMID 9224900 .  
  17. ^ a b Фонг, Бейли А; Вуд, Дэвид В. (2010). «Экспрессия и очистка белков-мишеней, меченных ELP-интеином, при ферментации E. coli с высокой плотностью клеток» . Фабрики микробных клеток . 9 (1): 77. DOI : 10,1186 / 1475-2859-9-77 . ISSN 1475-2859 . PMC 2978133 . PMID 20959011 .   
  18. ^ Син, Лэй; Ву, Вэй; Чжоу, Бихонг; Линь, Чжанлинь (2011). «Оптимизированная экспрессия и очистка белка с использованием расщепляемых самоагрегированных тегов» . Фабрики микробных клеток . 10 (1): 42. DOI : 10,1186 / 1475-2859-10-42 . ISSN 1475-2859 . PMC 3124420 . PMID 21631955 .   

Дальнейшее чтение [ править ]

  • Гогартен, Дж. Питер; Елена Иларио (2006). «Интеины, интроны и самонаводящиеся эндонуклеазы: недавние открытия о жизненном цикле паразитических генетических элементов» . BMC Evol Biol . 6 (1): 94. DOI : 10.1186 / 1471-2148-6-94 . ISSN  1471-2148 . PMC  1654191 . PMID  17101053 .

Внешние ссылки [ править ]

  • База данных Intein
  • База данных Intein Шмуэля Петроковского
  • Краткий обзор
  • Старокадомский пл. Сплайсинг белков, 2007 г.
  • Механизм сплайсинга белков и структура интеина
  • Protein + Splicing в Национальной медицинской библиотеке США по медицинским предметным рубрикам (MeSH)