Из Википедии, свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Быстрая амплификация концов кДНК ( RACE ) - это метод, используемый в молекулярной биологии для получения полной последовательности транскрипта РНК, обнаруженного в клетке. RACE приводит к получению копии кДНК интересующей последовательности РНК, полученной посредством обратной транскрипции с последующей амплификацией копий кДНК с помощью ПЦР (см. RT-PCR). Затем амплифицированные копии кДНК секвенируются и, если достаточно долго, должны отображаться в уникальной области генома. RACE обычно сопровождается клонированием перед секвенированием того, что изначально было отдельными молекулами РНК. Альтернативой с более высокой пропускной способностью, которая полезна для идентификации новых структур транскриптов, является секвенирование продуктов RACE с помощью технологий секвенирования следующего поколения.

Процесс [ править ]

RACE может обеспечивать последовательность транскрипта РНК от небольшой известной последовательности в транскрипте до 5 'конца (5' RACE-PCR) или 3 'конца (3' RACE-PCR) РНК. Этот метод иногда называют односторонней ПЦР или закрепленной ПЦР .

Первым шагом в RACE является использование обратной транскрипции для получения копии кДНК области транскрипта РНК. В этом процессе неизвестная конечная часть транскрипта копируется с использованием известной последовательности из центра транскрипта. Скопированная область ограничена известной последовательностью либо на 5 ', либо на 3' конце.

Протоколы для 5 'или 3' ГОНКИ немного отличаются. 5 'RACE-PCR начинается с использования мРНК в качестве матрицы для первого раунда реакции синтеза кДНК (или обратной транскрипции ) с использованием антисмыслового (обратного) олигонуклеотидного праймера, который распознает известную последовательность в середине интересующего гена; праймер называется ген специфического праймера (ГСП). Праймер связывается с мРНК, а ферментная обратная транскриптаза добавляет пары оснований к 3'-концу праймера для образования специфического одноцепочечного продукта кДНК; это обратный комплемент мРНК. После синтеза кДНК фермент терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза (TdT) используется для добавления строки идентичныхнуклеотиды , известные как гомополимерный хвост, на 3'-конце кДНК. (Есть и другие способы добавления 3'-концевой последовательности для первой цепи синтеза кДНК de novo, которые намного более эффективны, чем гомополимерные хвосты, но смысл метода остается тем же). Затем проводится ПЦР , в которой используется второй праймер, специфичный для антисмыслового гена (GSP2), который связывается с известной последовательностью, и смысловой (прямой) универсальный праймер (UP), который связывает гомополимерный хвост, добавленный к 3'-концам кДНК для амплификации продукта кДНК с 5'-конца.

3 'RACE-PCR использует естественный полиА-хвост, который существует на 3' конце всех мРНК эукариот, для праймирования во время обратной транскрипции, поэтому этот метод не требует добавления нуклеотидов с помощью TdT. кДНК генерируют с использованием праймера Oligo-dT -adaptor (праймера с короткой последовательностью нуклеотидов дезокситимина), который дополняет участок полиА и добавляет специальную последовательность адаптера к 5'-концу каждой кДНК. Затем используется ПЦР для амплификации 3'-кДНК из известной области с использованием смыслового GSP и антисмыслового праймера, комплементарного адапторной последовательности.

RACE-последовательность [ править ]

Этот кДНК - молекула , генерируемый RACE может быть секвенирована с использованием высокого пропускной последовательностью технологий (также называемым, RACE-SEQ). Определение характеристик фрагментов RACE с помощью высокопроизводительного секвенирования является высокоэффективным по времени, более чувствительным, менее дорогостоящим и технически осуществимым по сравнению с традиционной характеристикой фрагментов RACE с помощью молекулярного клонирования с последующим секвенированием нескольких клонов по Сэнгеру .

История и приложения [ править ]

RACE можно использовать для амплификации неизвестных 5 '(5'-RACE) или 3' (3'-RACE) частей молекул РНК, где часть последовательности РНК известна и нацелена на специфичный для гена праймер. В сочетании с высокопроизводительным секвенированием для характеристики этих амплифицированных продуктов RACE можно применить подход для характеристики любых типов кодирующих или некодирующих молекул РНК.

Идея комбинирования RACE с высокопроизводительным секвенированием была впервые представлена ​​в 2009 году как Deep-RACE для выполнения картирования сайтов начала транскрипции (TSS) 17 генов в одной клеточной линии. [1] Например, в исследовании 2014 г. по точному картированию сайтов расщепления целевой РНК, направляемой синтетическими миРНК , подход был впервые назван RACE-seq. [2] Кроме того, методология была использована для характеристики неизвестных частей полноразмерных новых транскриптов и гибридных транскриптов при колоректальном раке . [3] В другом исследовании, целью которого было охарактеризовать неизвестные структуры транскриптов днРНК , RACE использовался в сочетании с полудлинными454 секвенирование . [4]

Ссылки [ править ]

  1. ^ Olivarius, S; Плесси, К; Карнинчи, П. (февраль 2009 г.). «Высокопроизводительная проверка сайтов начала транскрипции с помощью Deep-RACE» (PDF) . Биотехнологии . 46 (2): 130–2. DOI : 10.2144 / 000113066 . PMID  19317658 .
  2. ^ Дениз, H; Moschos, SA; Сиддерс, Б. Бремя, F; Perkins, H; Картер, N; Страуд, Т; Кеннеди, М. Fancy, SA; Лапторн, С; Лаванда, H; Kinloch, R; Сухи, D; Корбау, Р. (4 февраля 2014 г.). «Понимание глубинного секвенирования терапевтической обработки shRNA и точности расщепления мишени siRNA» . Молекулярная терапия: нуклеиновые кислоты . 3 : e145. DOI : 10.1038 / mtna.2013.73 . PMC 3951910 . PMID 24496437 .  
  3. ^ Хофф, AM; Йоханнесен, B; Алагаратнам, S; Чжао, S; Ном, Т; Løvf, M; Баккен, AC; Hektoen, M; Свин, А; Lothe, RA; Скотейм, Р.И. (3 ноября 2015 г.). «Новые варианты РНК при колоректальном раке» . Oncotarget . 6 (34): 36587–602. DOI : 10.18632 / oncotarget.5500 . PMC 4742197 . PMID 26474385 .  
  4. ^ Лагард, Жюльен; Ущинска-Ратайчак, Барбара; Сантойо-Лопес, Хавьер; Гонсалес, Хосе Мануэль; Тапанари, Электра; Мадж, Джонатан М .; Стюард, Чарльз А .; Уилминг, Лоуренс; Танзер, Андреа; Ховальд, Седрик; Краст, Жаклин; Вела-Боза, Алисия; Руэда, Антонио; Лопес-Доминго, Франсиско Дж .; Допазо, Хоакин; Реймонд, Александр; Гиго, Родерик; Харроу, Дженнифер (17 августа 2016 г.). «Расширение транскриптов днРНК человека с помощью RACE в сочетании с долгосрочным высокопроизводительным секвенированием (RACE-Seq)» . Nature Communications . 7 : 12339. Bibcode : 2016NatCo ... 712339L . DOI : 10.1038 / ncomms12339 . PMC 4992054 . PMID  27531712 .
  • «Быстрая амплификация концов 5'-кДНК», в Molecular Cloning: A Laboratory Manual (ред. Sambrook, J. & Russell, DW), Глава 8, Протокол 9, 8.54-8,60 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York , США, 2001 г.)
  • Принципы манипуляции генами и геномики , С. Б. Примроуз и Р. М. Твайман, Blackwell Publishing, 2006 г. (7-е изд.), Страницы 111-12.

Внешние ссылки [ править ]

  • Статья в блоге о RACE-seq