Система SpyTag / SpyCatcher - это технология необратимого конъюгирования рекомбинантных белков. Пептида SpyTag (13 аминокислот ) спонтанно реагирует с белком SpyCatcher (12,3 кДа) , чтобы образовать межмолекулы изопептида связи между парой. [1] Последовательность ДНК, кодирующая либо SpyTag, либо SpyCatcher, может быть рекомбинантно введена в последовательность ДНК, кодирующую интересующий белок, с образованием слитого белка . Эти гибридные белки могут быть ковалентно связаны при смешивании в реакции через систему SpyTag / SpyCatcher.
Используя пару Tag / Catcher, можно достичь биоконъюгирования между двумя рекомбинантными белками, которое в противном случае было бы ограничительным или невозможным при традиционном прямом генетическом слиянии между двумя белками. Например, проблемы, касающиеся сворачивания белка, субоптимальной экспрессии хозяина и специализированных посттрансляционных модификаций, можно облегчить путем разделения продукции белков с помощью модульности системы Tag / Catcher. [2]
Механизм развития и реакции
SpyTag и SpyCatcher были сформированы в результате расщепления и конструирования домена CnaB2 белка FbaB из Streptococcus pyogenes , который естественным образом образует внутримолекулярную изопептидную связь, чтобы способствовать колонизации клетки-хозяина. [3] [4] С образованием изопептидной связи домен CnaB2 становится более устойчивым к конформационным, температурным изменениям и изменениям pH .
Основываясь на этом, SpyTag был получен из CnaB2 путем извлечения С-концевой бета-цепи, содержащей реактивную аспарагиновую кислоту на D556, и оставления остальных бета-цепей, содержащих реактивный лизин K470 и каталитическую глутаминовую кислоту на E516, чтобы впоследствии стать SpyCatcher. инженерия для удаления некоторых гидрофобных остатков с поверхности. Полученный SpyTag / SpyCatcher может реагировать с образованием изопептидной связи с константой скорости второго порядка 1,4 ± 0,4 × 10 3 M -1 с -1 . Предполагается [5], что механизм реакции осуществляется путем нуклеофильной атаки D556 со стороны K470, опосредованной E516. При воссоздании SpyTag: SpyCatcher полученный конъюгированный комплекс приобретает стабильность родительского домена CnaB2.
Затем с помощью фагового дисплея был создан SpyTag / SpyCatcher второго поколения под названием SpyTag002 / SpyCatcher002, который позволяет паре пептид-белок реагировать в 12 раз быстрее, чем исходная пара, с константой скорости 2,0 ± 0,2 × 10 4 M −1 с. −1 . [6] Во втором поколении SpyCatcher002 также отменена самореактивность, которая присутствует в SpyCatcher.
SpyTag / SpyCatcher третьего поколения под названием SpyTag003 / SpyCatcher003 теперь также был создан благодаря рациональному дизайну. Это реагирует до 400 раз быстрее, чем исходная пара с константой скорости 5,5 ± 0,6 × 10 5 M -1 с -1 . [7] Эта версия обратно реагирует с двумя предыдущими поколениями реагентов SpyTag / SpyCatcher.
SpyTag / SpyCatcher реагируют с высокой специфичностью даже в присутствии среды клеток бактерий и млекопитающих. [1] [6] [7]
Приложения
Благодаря своей специфичности, необратимому ковалентному связыванию и простоте использования система конъюгации SpyTag / SpyCatcher нашла множество различных применений. [5] [8] [9]
Производство вакцин
Путем слияния SpyTag или SpyCatcher с самособирающимися молекулами, такими как вирусоподобные частицы , антигены, слитые с другой парой, могут быть декорированы на молекуле посредством образованной изопептидной связи. [10] [11] [12] [13] Это позволяет быстро производить вакцины, так как центральная самособирающаяся молекула может быть заранее запасена, в то время как антиген может быть легко продуцирован в оптимальных условиях для достижения правильного сворачивания белка .
Циклизация ферментов
Циклизация ферментов путем слияния N- и C-концов белка помогает повысить устойчивость фермента к нагреванию. Если SpyTag и SpyCatcher вместе в ферменте на концах, фермент будет подвергаться спонтанной циклизации с образованием изопептидной связи. Циклизированные бета-лактамаза , фитаза , люцифераза светлячков и ксиланаза (и это лишь некоторые из них) показали сохраняющуюся ферментативную активность даже после воздействия тепла при 100 ° C. [14] [15]
Белковые гидрогели
Гидрогели нашли широкое применение в биомедицинских науках. Одним из обычно используемых типов исходного материала гидрогеля являются эластиноподобные полипептиды . Химия SpyTag / SpyCatcher использовалась для создания специализированных молекулярных сетей («сетей шпионов») в этих гидрогелях, которые позволяют инкапсулировать живые клетки млекопитающих, такие как фибробласты. [16] Последующие модификации сделали возможным формирование светочувствительного гидрогеля, [17] определяемый пользователем контроль над взаимодействиями клетки и материала, [18] комбинированные гиалуронан- эластиноподобные полипептиды [19], а также создание белковых каркасов для биокатализа потока ферментов . [20]
Расширенные пары Tag / Catcher
Перед разработкой SpyTag / SpyCatcher пара Isopeptag / Pilin-C была создана из белка Spy0128 Streptococcus pyogenes . [21] Вслед за SpyTag / SpyCatcher, полностью ортогональная пара SnoopTag / SnoopCatcher была разработана из белка RrgA Streptococcus pneumoniae , не обладающего перекрестной реактивностью со SpyTag / SpyCatcher. [22] Обратите внимание, что SnoopTag / SnoopCatcher образует изопептидную связь между Lys-Asn вместо Lys-Asp, как в SpyTag / SpyCatcher. Пара SdyTag / SdyCatcher также была разработана в том же году из домена CnaB фибронектинсвязывающего белка Streptococcus dysgalactiae, но поскольку этот белок имеет сходство последовательности с родительским белком, из которого происходит SpyTag / SpyCatcher, эта пара Tag / Catcher обладает перекрестной реактивностью. с последней парой. [23]
Вместо того чтобы находить гомологичные белки у разных видов, на основе SpyTag / SpyCatcher была разработана новая пара Tag / Catcher с минимальными мутациями . SpyTag I3W (A W ) реагирует с SpyCatcher F77V, F94A (B VA ), но минимально со SpyCatcher, тогда как SpyCatcher F77V, F94A могут реагировать как с SpyTag I3W, так и со SpyTag. [24] Однако перекрестная реактивность SpyCatcher F77V, F94A с обеими версиями SpyTag может ограничить его полезность в качестве новой пары Tag / Catcher.
Другая химия может быть использована для лигирования белка: открытие формации внутримолекулярной сложноэфирной связи в Clostridium Perfringens клеточной поверхности Адгезиновой белка Cpe0147 привело к разработке другого Tag / пару Catcher с Cpe0147 565-587 , как Tag и Cpe0147 439-563 как Ловец. [25] Сложноэфирная связь, образованная между Thr-Gln, необратима, однако при изменении Thr на Ser сложноэфирная связь Ser-Gln становится обратимой при изменении pH.
Очищение сродства Spy & Go
Мутация каталитического остатка глутаминовой кислоты (E77) в SpyCatcher на аланин останавливает образование изопептидной связи, но не предотвращает начальную нековалентную ассоциацию SpyTag / SpyCatcher. Это нековалентное взаимодействие SpyTag / SpyCatcher было использовано при аффинной очистке рекомбинантных белков, слитых с SpyTag . [26] В этой стратегии очистки, названной Spy & Go, иммобилизованный на смоле SpyCatcher используется для сбора слитых со SpyTag белков из супернатантов клеточных культур или клеточных лизатов. Неспецифически связанные белки удаляют промыванием смолы нейтральным буфером, а целевой белок элюируют при нейтральном pH с использованием высокой концентрации имидазола .
Аффинная смола Spy & Go основана на варианте SpyCatcher2.1 E77A S49C, называемом SpyDock. [26] SpyDock может быть экспрессирован в E. coli в виде растворимого белка, очищенного с использованием Ni-NTA и анионообменных смол и иммобилизованного на йодацетил-активированной агарозе через неспаренный цистеин, введенный заменой S49C. В нейтральных буферах с физиологической концентрацией соли SpyDock связывается со слитыми белками SpyTag и SpyTag002 с аффинностью в высоком наномолярном диапазоне (K d = 750 ± 50 нМ для SpyTag, K d = 73 ± 13 нМ для SpyTag002). [26] О сродстве к SpyTag003 не сообщалось, но для обеспечения полной диссоциации требуются более жесткие условия, что предполагает более плотное связывание. [7] Связанные со SpyDock белки элюируют путем инкубации смолы с 2,5 М имидазолом в нейтральном буфере. [26] Смолу SpyDock можно регенерировать несколько раз, используя последовательные промывки 4 М имидазолом, 6 М гидрохлоридом гуанидиния и 0,1 М NaOH. [26]
Сообщалось об очистке белков Spy & Go с помощью N-концевого, внутреннего или C-концевого SpyTag. [7] [26] Смола SpyDock совместима со всеми поколениями SpyTag (SpyTag, [1] SpyTag002, [6] SpyTag003 [7] ) и не мешает более поздней ковалентной конъюгации очищенных белков с помощью SpyCatcher. [26]
Смотрите также
- Белковая метка
- Биоконъюгация
- Биомолекулярная инженерия
- Изопептидная связь
Рекомендации
- ^ a b c Закери Б., Фирер Дж. О., Челик Э., Читток Э. К., Шварц-Линек Ю., Мой В. Т., Ховарт М. (март 2012 г.). «Пептидная метка, образующая быструю ковалентную связь с белком посредством конструирования бактериального адгезина» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 109 (12): E690-7. DOI : 10.1073 / pnas.1115485109 . PMC 3311370 . PMID 22366317 .
- ^ Брун К.Д., Ховарт М. (26 июня 2018 г.). «Новые пути и возможности для модульного создания твердых частиц вакцин: приклеить, щелкнуть и приклеить» . Границы иммунологии . 9 : 1432. DOI : 10.3389 / fimmu.2018.01432 . PMC 6028521 . PMID 29997617 .
- ^ Канг Х. Дж., Бейкер EN (апрель 2011 г.). «Внутримолекулярные изопептидные связи: сшивки белков, созданные для стресса?». Направления биохимических наук . 36 (4): 229–37. DOI : 10.1016 / j.tibs.2010.09.007 . PMID 21055949 .
- ^ Hagan RM, Björnsson R, McMahon SA, Schomburg B, Braithwaite V, Bühl M и др. (Ноябрь 2010 г.). «ЯМР-спектроскопический и теоретический анализ спонтанно образованной изопептидной связи Lys-Asp» . Angewandte Chemie . 49 (45): 8421–5. DOI : 10.1002 / anie.201004340 . PMC 3315829 . PMID 20878961 .
- ^ а б Реддингтон SC, Ховарт М. (декабрь 2015 г.). «Секреты ковалентного взаимодействия для биоматериалов и биотехнологий: SpyTag и SpyCatcher» . Текущее мнение в химической биологии . 29 : 94–9. DOI : 10.1016 / j.cbpa.2015.10.002 . PMID 26517567 .
- ^ а б в Кибл А.Х., Банерджи А., Ферла МП, Реддингтон СК, Ануар И.Н., Ховарт М. (декабрь 2017 г.). «Развитие ускоренного амидирования с помощью SpyTag / SpyCatcher для анализа динамики мембраны» . Angewandte Chemie . 56 (52): 16521–16525. DOI : 10.1002 / anie.201707623 . PMC 5814910 . PMID 29024296 .
- ^ а б в г д Кибл А.Х., Турки П., Стокс С., Хайрил Ануар И.Н., Рахикайнен Р., Хитёнен В.П., Ховарт М. (декабрь 2019 г.). «Приближение к бесконечному сродству через разработку пептидно-белкового взаимодействия» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 116 (52): 26523–26533. DOI : 10.1073 / pnas.1909653116 . PMC 6936558 . PMID 31822621 .
- ^ Банерджи А., Ховарт М. (июнь 2018 г.). «Нанокомандная работа: ковалентная сборка белков за пределами дуэтов по отношению к белковым ансамблям и оркестрам» . Текущее мнение в области биотехнологии . 51 : 16–23. DOI : 10.1016 / j.copbio.2017.10.006 . PMID 29172131 .
- ^ Кибл А.Х., Ховарт М. (2019). «Инсайдерская информация об успешном ковалентном связывании белков с помощью SpyBank». Методы в энзимологии . 617 : 443–461. DOI : 10.1016 / bs.mie.2018.12.010 . ISBN 9780128170748. PMID 30784412 .
- ^ Brune KD, Buldun CM, Li Y, Taylor IJ, Brod F, Biswas S, Howarth M (май 2017 г.). «Синтетическая сборка с двойным подключением и дисплеем с использованием ортогональных реактивных белков для иммунизации двойным антигеном» . Биоконъюгатная химия . 28 (5): 1544–1551. DOI : 10.1021 / acs.bioconjchem.7b00174 . PMID 28437083 .
- ^ Трейн С., Яницек С.М., Матондо С., Резенде М., Густавссон Т., де Йонг В.А. и др. (Апрель 2016 г.). «Бактериальный суперклей позволяет легко разрабатывать эффективные вакцины на основе вирусоподобных частиц» . Журнал нанобиотехнологий . 14 (1): 30. DOI : 10,1186 / s12951-016-0181-1 . PMC 4847360 . PMID 27117585 .
- ^ Брун К.Д., Ленеган Д.Б., Брайан И.Дж., Ишизука А.С., Бахманн М.Ф., Дрейпер С.Дж. и др. (Январь 2016 г.). «Plug-and-Display: украшение вирусоподобных частиц с помощью изопептидных связей для модульной иммунизации» . Научные отчеты . 6 (1): 19234. Bibcode : 2016NatSR ... 619234B . DOI : 10.1038 / srep19234 . PMC 4725971 . PMID 26781591 .
- ^ Тан, Тионг Кит; Риджал, Прамила; Рахикайнен, Ролле; Кибл, Энтони Х .; Шиманский, Лиза; Хуссейн, Сайра; и другие. (22 января 2021 г.). «Вакцина-кандидат от COVID-19, использующая мультимеризацию SpyCatcher рецептор-связывающего домена шипового белка SARS-CoV-2, вызывает мощные нейтрализующие реакции антител» . Nature Communications . 12 (1): 542. DOI : 10.1038 / s41467-020-20654-7 . ISSN 2041-1723 .
- ^ Шоне С., Беннет С.П., Ховарт М. (16 июня 2016 г.). «Рассекреченные SpyRings: План использования изопептид-опосредованной циклизации для повышения термостойкости ферментов». Методы в энзимологии . 580 : 149–67. DOI : 10.1016 / bs.mie.2016.05.004 . ISBN 9780128053805. PMID 27586332 .
- ^ Гилберт С., Ховарт М., Харвуд С. Р., Эллис Т. (июнь 2017 г.). «Внеклеточная самосборка функциональных и настраиваемых белковых конъюгатов из Bacillus subtilis» . Синтетическая биология ACS . 6 (6): 957–967. DOI : 10.1021 / acssynbio.6b00292 . PMID 28230977 .
- ^ Сунь Ф., Чжан В.Б., Махдави А., Арнольд Ф.Х., Тиррелл Д.А. (август 2014 г.). «Синтез биоактивных белковых гидрогелей с помощью генетически закодированной химии SpyTag-SpyCatcher» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 111 (31): 11269–74. Bibcode : 2014PNAS..11111269S . DOI : 10.1073 / pnas.1401291111 . PMC 4128157 . PMID 25049400 .
- ^ Ван Р, Ян З, Ло Дж, Син И.М., Сунь Ф (июнь 2017 г.). «12-зависимые светочувствительные белковые гидрогели для контролируемого высвобождения стволовых клеток / белка» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 114 (23): 5912–5917. DOI : 10.1073 / pnas.1621350114 . PMC 5468657 . PMID 28533376 .
- ^ Хаммер Дж. А., Рута А., Териен А. М., Вест Дж. Л. (июль 2019 г.). «Совместимая с клетками, сайт-специфическая ковалентная модификация гидрогелевых каркасов позволяет определять пользовательский контроль над взаимодействиями клетка-материал». Биомакромолекулы . 20 (7): 2486–2493. DOI : 10.1021 / acs.biomac.9b00183 . PMID 31121097 .
- ^ Wieduwild R, Howarth M (октябрь 2018 г.). «Сборка и декорирование гиалуронановых гидрогелей с помощью суперклейких белков-близнецов для имитации межклеточных взаимодействий» . Биоматериалы . 180 : 253–264. DOI : 10.1016 / j.biomaterials.2018.07.020 . PMID 30053659 .
- ^ Пешке Т., Горький Волк П., Галлус С., Ху Y, Эльшлэгер С., Вилленбахер Н. и др. (Декабрь 2018 г.). "Самособирающиеся полностью ферментные гидрогели для проточного биокатализа". Angewandte Chemie . 57 (52): 17028–17032. DOI : 10.1002 / anie.201810331 . PMID 30380178 .
- ^ Закери Б., Ховарт М. (апрель 2010 г.). «Спонтанное образование межмолекулярной амидной связи между боковыми цепями для необратимого нацеливания на пептиды». Журнал Американского химического общества . 132 (13): 4526–7. CiteSeerX 10.1.1.706.4839 . DOI : 10.1021 / ja910795a . PMID 20235501 .
- ^ Веггиани Г., Накамура Т., Бреннер М.Д., Гайет Р.В., Ян Дж., Робинсон К.В., Ховарт М. (февраль 2016 г.). «Программируемые полипротеамы, построенные с использованием двойных пептидных суперклеев» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 113 (5): 1202–7. Bibcode : 2016PNAS..113.1202V . DOI : 10.1073 / pnas.1519214113 . PMC 4747704 . PMID 26787909 .
- ^ Тан Л.Л., Хун С.С., Вонг FT (26 октября 2016 г.). «Кинетические контролируемые взаимодействия меток-улавливателей для направленной сборки ковалентных белков» . PLOS ONE . 11 (10): e0165074. Bibcode : 2016PLoSO..1165074T . DOI : 10.1371 / journal.pone.0165074 . PMC 5082641 . PMID 27783674 .
- ^ Лю Ю., Лю Д., Ян В., Ву XL, Лай Л., Чжан В.Б. (сентябрь 2017 г.). «Настройка пар мутантов SpyTag-SpyCatcher для ортогонального шифрования реактивности» . Химическая наука . 8 (9): 6577–6582. DOI : 10.1039 / C7SC02686B . PMC 5627348 . PMID 28989685 .
- ^ Янг П.Г., Йосаатмаджа Й., Харрис П.В., Люнг И.К., Бейкер EN, Сквайр С.Дж. (январь 2017 г.). «Использование сложноэфирной связи химии для лигирования белков». Химические коммуникации . 53 (9): 1502–1505. DOI : 10.1039 / C6CC09899A . PMID 28084475 .
- ^ Б с д е е г Хайрил Ануар И.Н., Банерджи А., Кибл А.Х., Карелла А., Ников Г.И., Ховарт М. (апрель 2019 г.). «Очистка Spy & Go SpyTag-белков с использованием псевдо-SpyCatcher для доступа к инструментарию олигомеризации» . Nature Communications . 10 (1): 1734. Bibcode : 2019NatCo..10.1734K . DOI : 10.1038 / s41467-019-09678-ш . PMC 6465384 . PMID 30988307 .