Из Википедии, свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Кофакторная инженерия , подмножество метаболической инженерии , определяется как манипулирование использованием кофакторов в метаболических путях организма . В инженерии кофакторов концентрации кофакторов изменяются, чтобы максимизировать или минимизировать метаболические потоки. Этот тип инженерии можно использовать для оптимизации производства продукта метаболизма или для повышения эффективности метаболической сети.. Использование инженерных одноклеточных организмов для создания прибыльных химикатов из дешевого сырья растет, и разработка кофакторов может сыграть решающую роль в максимальном увеличении производства. Эта область приобрела большую популярность в последнее десятилетие и имеет несколько практических применений в химической промышленности, биоинженерии и фармацевтической промышленности. [1]

Кофакторы - это небелковые соединения, которые связываются с белками и необходимы для нормальной каталитической функции белков . Кофакторы можно рассматривать как «вспомогательные молекулы» в биологической активности, и они часто влияют на функциональность ферментов. Кофакторы могут быть как органическими, так и неорганическими соединениями. Некоторые примеры неорганических кофакторов являются железо или магний, а также некоторые примеры органических кофакторов включают АТФ или кофермент А . Органические кофакторы более конкретно известны как коферменты., и многие ферменты требуют добавления коферментов для выполнения нормальной каталитической функции в метаболической реакции. Коферменты связываются с активным центром фермента, способствуя катализу. Создавая кофакторы и коферменты, можно управлять естественной метаболической реакцией, чтобы оптимизировать работу метаболической сети. [2] [3] [4]

Общий кофактор НАДН , обнаруженный первым.

Фон [ править ]

Кофакторы были открыты Артуром Харденом и Уильямом Янгом в 1906 году, когда они обнаружили, что скорость спиртового брожения в некипяченых дрожжевых экстрактах увеличивается при добавлении вареного дрожжевого экстракта. [5] Через несколько лет Ганс фон Эйлер-Челпин идентифицировал кофактор в вареном экстракте как NAD + . Другие кофакторы, такие как АТФ и кофермент А, были открыты позже, в 1900-х годах. Механизм активности кофактора был открыт, когда Отто Генрих Варбург в 1936 году определил, что НАД + действует какакцептор электронов . После этих первых открытий ученые начали понимать, что манипуляции с концентрацией кофакторов можно использовать в качестве инструментов для улучшения метаболических путей . [1]

Важной группой органических кофакторов является семейство молекул, называемых витаминами . Например, витамин B12 (кобаламин) играет решающую роль в организме человека, а его производное - кофермент B12 - присутствует в метаболизмах всех типов клеток нашего тела. Его присутствие влияет на синтез и регулирование клеточной ДНК, а также на участие в синтезе жирных кислот и выработке энергии. Кофакторы необходимы для многих важных метаболических путей , и концентрация одного типа кофактора может влиять на потоки многих различных путей.

Минералы и ионы металлов, которые организмы поглощают с пищей, являются яркими примерами неорганических кофакторов. Например, Zn 2+ необходим для поддержки фермента карбоангидразы, поскольку он превращает диоксид углерода и воду в бикарбонат и протоны. Широко признанный минерал, который действует как кофактор, - это железо, которое необходимо для правильного функционирования гемоглобина , белка, транспортирующего кислород, который содержится в красных кровяных тельцах . Этот пример, в частности, подчеркивает важность кофакторов в метаболизме животных .

Значение [ править ]

Кофакторная инженерия играет важную роль в манипулировании метаболическими путями . Метаболический путь - это серия химических реакций, происходящих в организме. Метаболическая инженерия - это предмет изменения потоков внутри метаболического пути. В метаболической инженерии метаболический путь можно напрямую изменить, изменив функциональность ферментов, участвующих в этом пути. Кофакторная инженерия предлагает особый подход и некоторые преимущества для изменения метаболического пути. Вместо изменения ферментов, используемых в пути, можно изменить кофакторы. Это может дать метаболическим инженерам преимущество благодаря определенным свойствам кофакторов и способам их модификации.

Метаболические пути могут использоваться инженерами-метаболиками для создания желаемого продукта. Изменяя типы используемых кофакторов и время, в которое они используются, результаты метаболической сети могут измениться. Чтобы увеличить производство продукта, инженеры-метаболисты имеют возможность снабдить сеть любым кофактором, который лучше всего подходит для этого конкретного процесса. Это приводит к оптимизации сетей для увеличения производства желаемой продукции. Кроме того, изменение кофакторов, используемых в сети, может быть оригинальным решением сложной проблемы. Сеть, которая присутствует в ячейке, но часто не используется, может иметь желаемый продукт. Вместо разработки совершенно нового набора способов производства продукта можно применить кооперативную инженерию. Заменяя ферменты на кофакторы, легко доступные в клетке,обычно неиспользуемая сеть больше не ограничивается кофакторами, и производство может быть увеличено.

Помимо изменения выхода метаболических сетей, изменение кофакторов, используемых в сети, может снизить эксплуатационные расходы при попытке сформировать желаемый продукт. НАДН и НАДФН - два чрезвычайно распространенных клеточных кофактора, различающиеся только наличием фосфатной группы. Однако эта фосфатная группа делает НАДФН намного менее стабильным, чем НАДН, и, следовательно, более дорогим для синтеза. Таким образом, полезно попробовать и использовать NADH в некоторых сотовых сетях, потому что он часто дешевле, более доступный и выполняет ту же задачу, что и NADPH.

Инструменты и процессы [ править ]

Кофакторная инженерия чаще всего связана с манипуляциями с такими микроорганизмами , как Saccharomyces cerevisiae и Escherichia coli , и поэтому требует использования методов рекомбинантной ДНК . В этих методах используются небольшие кольцевые сегменты ДНК, называемые плазмидами , которые могут быть введены и включены микроорганизмами, такими как Escherichia coli . Эти плазмиды специально разработаны в лабораториях, чтобы их можно было легко включить и повлиять на экспрессию различных белков , метаболитов и ферментов . Например, конкретная плазмида может вызывать изменение фермента.аминокислотная последовательность, которая может увеличить его сродство к определенному субстрату .

Микроорганизмам требуется среда для роста, и для культур Escherichia coli обычно используется бульон Лурия-Бертани (LB). Эта среда часто дополняется глюкозой и часто содержит дополнительные молекулы, предназначенные для облегчения оптимального роста культуры. Затем предварительные культуры можно выращивать во встряхиваемых колбах. Это просто закупоренные колбы Эрленмейера, которые оставляют на орбитальном шейкере, который вращается с очень высокой частотой вращения.. Этот процесс обеспечивает аэрацию культуры, что необходимо для оптимального роста. Когда предварительные культуры готовы, плазмиды, необходимые для конкретных экспериментов, добавляются к каждой культуре отдельно, а затем каждую культуру переносят в биореактор. Биореакторы - это системы, которые позволяют культурам расти в контролируемой среде. Это оставляет введенные плазмиды в качестве единственной независимой переменной. Биореактор может поддерживать необходимую температуру, pH , концентрацию метаболитов и различные другие факторы окружающей среды, обеспечивая идентичные условия роста для каждой культуры.

Как только образцам дают возможность расти в реакторе в течение определенного периода, их можно удалить и изучить, чтобы определить, очевидны ли предполагаемые изменения в организме. Поскольку кофакторная инженерия чаще всего связана с метаболическими путями , эти организмы часто изучаются, но вводятся специфические меченые флуоресцентные метаболиты и документируется их прогрессирование по различным путям. В других случаях результаты более очевидны и легко наблюдаемы, например, при снижении выработки этанола дрожжами, о чем говорится ниже.[3] [4]

Приложения [ править ]

Изменение кофактора фермента с НАДФН на НАДН [ править ]

Биокатализаторы необходимы для производства хиральных строительных блоков, необходимых в фармацевтических препаратах и ​​других химических веществах, используемых обществом. Для многих таких биокатализаторов в качестве кофактора требуется НАДФН . НАДФН, кофактор, очень похожий на НАДН, является более дорогим и менее стабильным, чем его аналог НАДН . По этим причинам производители предпочли бы, чтобы биокатализаторы, которые они используют в своих производственных линиях, принимали НАДН, а не НАДФН. Кофакторная инженерия недавно оказалась успешной в изменении ферментов, которые предпочли НАДН в качестве кофактора вместо НАДФН. В 2010 году группа ученых выполнила разработку кофактора фермента Gre2p, NADPH-предпочтительной дегидрогеназы, обнаруженной вSaccharomyces cerevisiae . Gre2p восстанавливает соединение дикетон 2,5-гександион до хиральных строительных блоков (5S) -гидрокси-2-гексанон и (2S, 5S) -гександиол. Ученые определили, что Asn9 ( аспарагин , положение 9) является важной аминокислотой активного сайта Gre2p. В частности, Asn9 связывается с 3'-гидроксильной группой и 2'-атомом кислорода аденилрибозного фрагмента . Посредством прямого мутагенеза ученые заменили Asn9 как на Asp ( аспарагиновую кислоту ), так и на Glu ( глутаминовую кислоту).). Это изменение привело к уменьшению зависимости Gre2p от NADPH и к увеличению сродства к NADH. Это привело к увеличению активности Gre2p при использовании NADH. Было замечено, что замена Asn9 на Glu дает больший эффект, чем замена Asn9 на Asp. Asn содержит полярную незаряженную боковую цепь, в то время как как Asp, так и Glu содержат полярную заряженную боковую цепь. Повышенный эффект Glu вызван дополнительным углеродом в его боковой цепи, который приближает его к аденил-рибозной части. Это обеспечивает более прочную водородную связь между гидроксильными группами 2'- и 3'-рибозы и карбоксильной группой боковой цепи.группа. Максимальная скорость реакции увеличилась вдвое при использовании NADH, когда Asn9 был заменен Glu. Получив эти результаты, ученые успешно сконструировали Gre2p, который предпочел НАДН над НАДФН, и увеличили скорость восстановления 2,5-гександиона. Это позволит химическим компаниям снизить свои производственные затраты за счет использования NADH вместо NADPH, по крайней мере, для этого конкретного сокращения. [6]

Изменение предпочтения кофактора сети [ править ]

Альтернативный пример изменения предпочтения фермента кофакторам - это изменение НАДН-зависимой реакции на НАДФН-зависимые реакции. В этом примере сами ферменты не изменяются, но вместо этого выбираются разные ферменты, которые проводят ту же реакцию с использованием другого кофактора. Был создан инженерный путь для получения 1-бутанола из ацетил-КоА путем изменения ферментов метаболического пути S. elongatus . Clostridiumрод, как известно, продуцирует 1-бутанол, обеспечивая путь, который может быть встроен в S. elongatus. Этот путь синтезирует 1-бутанол с использованием пути обратного β-окисления. Ферменты, участвующие в этом недавно созданном пути, были НАДН-специфичными, что было проблематично для репликации пути у S. elongatus, поскольку цианобактерии производят намного больше НАДФН, чем НАДН.

Затем исследовательская группа определила ферменты, которые используют НАДФН или как НАДФН, так и НАДН путем биоразведки.. Было обнаружено, что ацетоацетил-КоА редуктаза (PhaB) является подходящей заменой гидроксимасляной дегидрогеназы (Hbd). Чтобы заменить AdhE2, исследователи обнаружили, что НАДФ-зависимая алкогольдегидрогеназа (YqhD) из E. coli эффективна для этого пути. Кроме того, исследователям нужна была дегидрогеназа, чтобы заменить способность AdhE2 к альдегиддегидрогеназе. Было обнаружено, что CoA-ацилирующая бутиральдегиддегидрогеназа (Bldh) из C. saccharoperbutylacetonicum является хорошим вариантом. Вместе PhaB, Bldh, YqhD могут заменять Hbd и AdhE2 соответственно, чтобы изменить предпочтительный кофактор восстановления 3-кетобутирил-КоА с использования NADH на использование NADPH. Затем авторы сконструировали различные комбинации различных ферментов (из тех, что обнаружены в пути обратного окисления и ферментов, использующих НАДФН) путем сверхэкспрессии различных генов в культурах S.elongatus PCC 7942. Для этого они построилиплазмиды, содержащие гены, соответствующие ферментам, и объединили их в геном S. elongates. После ферментных анализов штамм цианобактерий, экспрессирующих НАДФН с использованием ферментов, продуцировал наибольшее количество 1-бутанола (29,9 мг / л), в четыре раза превышающее количество штаммов, не содержащих НАДФН, использующих ферменты. В целом, 1-бутанол продуцировался в S. elongatus с использованием пути из другого организма. Этот путь был модифицирован, чтобы соответствовать предпочтительному восстанавливающему кофактору цианобактерий. [7]

Изменение потока метаболитов с помощью равновесия кофакторов [ править ]

В кофакторной инженерии метаболический путь изменяется путем изменения концентраций определенных кофакторов, которые продуцируются либо на этом конкретном пути, либо на отдельном пути. Например, гипотетический организм может иметь два произвольных пути, называемых A и B, где некоторые ферменты как в A, так и в B используют одни и те же кофакторы. Если ученые захотят уменьшить выход пути A, они могут сначала рассмотреть вопрос о непосредственной инженерии ферментов, участвующих в A, возможно, для уменьшения сродства конкретного активного сайта к его субстрату.. Однако в некоторых случаях ферменты в A может быть трудно сконструировать по разным причинам, или может быть невозможно сконструировать их без опасного воздействия на какой-то третий метаболический путь C, в котором используются те же ферменты. В качестве отдельного варианта ученые могут увеличить поток B, что может быть проще спроектировать. Это, в свою очередь, может «связать» кофакторы, необходимые для A, что замедлит ферментативную активность., уменьшая результат в A. Это один гипотетический пример того, как можно использовать кофакторную инженерию, но есть много других уникальных случаев, когда ученые используют кофакторы как способ изменения метаболических путей. Главное преимущество кофакторной инженерии состоит в том, что ученые могут использовать ее для успешного изменения метаболических путей, которые сложно спроектировать с помощью обычной метаболической инженерии. Это достигается за счет нацеливания более легко конструируемых ферментов отдельными путями, в которых используются одни и те же кофакторы. Поскольку многие кофакторы используются разными ферментами в нескольких путях, инженерия кофакторов может быть эффективной и рентабельной альтернативой существующим методам метаболической инженерии. [8]

Смотрите также: Дрожжи в виноделии

Дрожжи обычно используются в пивоваренной и винодельческой промышленности, поскольку они способны эффективно производить этанол путем метаболического брожения в отсутствие кислорода. Для ферментации необходим фермент глицерин-3-фосфатдегидрогеназа (GPDH), который зависит от кофактора NADH . Этот путь включает превращение глюкозы как в этанол, так и в глицерин , оба из которых используют НАДН в качестве кофактора . Ученые разработали Saccharomyces cerevisiae для избыточного производства GPDH, который сдвигает метаболический поток клеток.от этанола к глицерину, ограничивая доступность НАДН в части пути выработки этанола. Противоположный эффект был достигнут путем воздействия на отдельный путь в клетке - путь синтеза глутамата . Инактивация экспрессии фермента глутаматдегидрогеназы , которая зависит от НАДФН , и чрезмерная экспрессия ферментов глутаминсинтетазы и глутаматсинтетазы , которые полагаются на НАДН в качестве кофактора, сдвинули баланс кофакторов в пути синтеза глутамата. Этот путь теперь зависит от НАДН, а не от НАДФН, что снижает доступность НАДН в пути ферментации. Это, в свою очередь, приводит к увеличению производства этанола и снижению глицерина.производство. Этот метод управления метаболическими потоками можно представить себе во многом как глобальные рынки топлива, где увеличение производства этанола для использования в автомобильной промышленности уменьшит его доступность в пищевой промышленности. По сути, производство большего количества двигателей, работающих на этаноле, может привести к снижению потребления обработанных сладостей, которые содержат кукурузный сироп с высоким содержанием фруктозы . Эта разработка кофакторов применима к пивоваренной и винодельческой промышленности, поскольку она позволяет регулировать уровень этанола в алкогольных напитках. Достижения в винодельческой промышленности привели к неуклонному увеличению содержания этанола, поэтому виноделы, в частности, будут заинтересованы в возможности снижения уровня этанола в некоторых из своих вин. [3]

Цикл лимонной кислоты [ править ]

Коэнзим A (CoA) и ацетил-CoA - это два промежуточных метаболита , наиболее заметно присутствующие в цикле лимонной кислоты , которые участвуют в более чем 100 различных реакциях метаболизма микроорганизмов. Недавние эксперименты показали, что сверхэкспрессия фермента пантотенаткиназы и добавление пантотеновой кислоты в пути биосинтеза КоА позволили регулировать потоки как КоА, так и ацетил-КоА. Эта повышенная концентрация кофакторов привела к увеличению потока углерода в изоамилацетате.путь синтеза, повысить эффективность производства изоамилацетата. Изоамилацетат используется в промышленности для искусственных ароматизаторов и для проверки эффективности респираторов . Помимо производства изоамилацетата, манипуляции с биосинтезом КоА во время реакции пируват гидрогеназы также вызывают увеличение производства как сукцината, так и ликопина , каждый из которых оказывает благотворное влияние на организм человека. Увеличение концентрации сукцината, который используется в качестве катализатора , может привести к увеличению скорости цикла лимонной кислоты и, следовательно, к увеличению метаболизма человека.. Было показано, что увеличение концентрации ликопина снижает риск рака простаты . Потенциальные выгоды от повторения такого подвига кофакторной инженерии и успешного внедрения их в отраслевую практику бесчисленны. [4] [9] [10]

Производство бумаги [ править ]

Многие важные промышленные ферменты используют кофакторы для катализа реакций. Используя кофакторы для управления метаболическими путями , можно снизить стоимость материалов, исключить этапы производства, сократить время производства, уменьшить загрязнение и повысить общую эффективность производства. Один случай, демонстрирующий некоторые из этих производственных преимуществ, связан с генной инженерией осин . В процессе производства бумаги предприятия-производители должны расщеплять лигнин., биохимическое соединение, которое придает жесткость стволу дерева, чтобы сформировать мякоть, используемую на протяжении всего остального производства. Процесс химической варки целлюлозы требует от производственного предприятия использования значительного количества энергии, а также многих дорогих и токсичных химикатов. Группа генных инженеров с помощью кофакторной инженерии сконструировала осиновое дерево генетически лучшего качества , производившее меньше лигнина. Эти генно-инженерные деревья позволили бумажным фабрикам сократить свои затраты, загрязнение и время производства. [1] [11]

Другие примеры [ править ]

ОрганизмЧто изменилосьЧто это означает
Микобактерии смегматисКоэнзим F420Может отключить кофактор , ведущий к лекарственно-устойчивому туберкулезу [12]
ЦианобактерииКофактор железо-молибденовыйПроизводство газообразного водорода для энергетики [13]
Королевство АрчеяМолибден нитрогеназного КофакторПовышение эффективности азотфиксации [14]
Термоанаэробактерии mathraniiглицериндегидрогеназаЗаставить термофильные бактерии более эффективно производить этанол [15]

Краткое описание других важных примеров использования кофакторной инженерии.

Заметки [ править ]

  1. ^ a b c Рааб, Майкл; Кейт Тайро; Грегори Стефанопулос (2005). «Метаболическая инженерия». Достижения в области биохимической инженерии / биотехнологии . 100 (763): 1–17. DOI : 10.1007 / b136411 . PMID  16270654 .
  2. ^ Поллак, N; C Dolle; М. Циглер (2006). «Способность восстанавливать: пиридиновые нуклеотиды - небольшие молекулы с множеством функций» . Биохимия . 402 (2): 205–218. DOI : 10.1042 / BJ20061638 . PMC 1798440 . PMID 17295611 .  
  3. ^ a b c Heux, Стефани; Реми Качон; Сильви Декуин (2006). «Кофакторная инженерия в Saccharomyces cerevisiae: экспрессия H2O-образующей NADH-оксидазы и влияние на окислительно-восстановительный метаболизм». Метаболическая инженерия . 8 (4): 303–314. DOI : 10.1016 / j.ymben.2005.12.003 . PMID 16473032 . 
  4. ^ a b c Вадали, Равишанкар; Джордж Беннетт (апрель 2004 г.). «Кофакторная инженерия внутриклеточного КоА / ацетил-КоА и его влияние на перераспределение метаболического потока в Escherichia coli». Метаболическая инженерия . 6 (2): 133–139. DOI : 10.1016 / j.ymben.2004.02.001 . PMID 15113566 . 
  5. ^ Артур Харден и Уильям Джон Янг. «Алкогольная закваска дрожжевого сока». Труды Лондонского королевского общества. Серия B, Содержащие документы биологического характера, Vol. 77, No. 519 (12 апреля 1906 г.), стр. 405-420 JSTOR
  6. ^ Кацберг, Майкл; Надя Скорупа-Парачин; Мари-Франсуаза Горва-Грауслунд; Мартин Бертау (2010). «Предпочтение инженерных кофакторов для биокатализаторов, восстанавливающих кетон: исследование мутагенеза γ-дикетонредуктазы из дрожжевых Saccharomyces cerevisiae» . Международный журнал молекулярных наук . 11 (4): 1735–1758. DOI : 10.3390 / ijms11041735 . PMC 2871135 . PMID 20480039 .  
  7. ^ Итан Лан; Джеймс Ляо. «АТФ способствует прямому фотосинтетическому производству 1-бутанола в цианобактериях» . Труды Национальной академии наук . Проверено 11 декабря 2012 года .
  8. ^ Сан, Ка-Ю; Джордж Н. Беннетт; Сусана Дж. Берриос-Ривера; Рави В. Вадали; Йеа-Тынг Ян; Эмили Хортон; Фред Б. Рудольф; Берна Сарияр; Кимати Блэквуд (апрель 2002 г.). «Метаболическая инженерия через манипуляции с кофакторами и ее влияние на перераспределение метаболического потока в кишечной палочке кишечной палочки». Метаболическая инженерия . 4 (2): 182–193. DOI : 10.1006 / mben.2001.0220 . PMID 12009797 . [ мертвая ссылка ]
  9. ^ Джованнуччи, Эдвард; Альберто Аскерио; Эрик Римм; Меир Штампфер; Грэм Колдиц; Уолтер Уиллетт (май 1995 г.). «Потребление каротиноидов и ретино в связи с риском рака простаты». Журнал Национального института рака . 87 (23): 1767–1776. DOI : 10.1093 / JNCI / 87.23.1767 . PMID 7473833 . 
  10. ^ Потера, Кэрол (декабрь 2005 г.). «Сделать сукцинат более успешным» . Перспективы гигиены окружающей среды . 113 (12): A832 – A835. DOI : 10.1289 / ehp.113-a832 . PMC 1314946 . PMID 16330341 .  
  11. ^ Хорват, Ласло; Илона Пешлен; Перри Перальта; Богумил Касал; Лайгенг Ли (2010). «Механические свойства генетически модифицированной молодой осины с измененным содержанием и / или структурой лигнина». Наука о древесине и волокне . 42 .
  12. ^ Башири, G; Rehan, AM; Гринвуд, ДР; Диксон, JM; Бейкер, EN (2010). «Метаболическая инженерия производства кофактора F420 у Mycobacterium smegmatis» . PLOS One . 5 (12): e15803. DOI : 10.1371 / journal.pone.0015803 . PMC 3012119 . PMID 21209917 .  
  13. ^ Масукава, H; Иноуэ, К; Сакураи, H; Wolk, CP; Hausinger, RP. (2010). «Сайт-направленный мутагенез активного сайта нитрогеназы штамма Anabaena PCC 7120 для увеличения фотобиологической продукции водорода» . Прикладная и экологическая микробиология . 76 (20): 6741–50. DOI : 10,1128 / aem.01056-10 . PMC 2953041 . PMID 20709836 .  
  14. ^ Эрнандес, JA; Curatti, L; Азнар, CP; Перова, З .; Britt, RD; Рубио, Л. (2008). «Транспортировка металлов для фиксации азота: NifQ отдает молибден NifEN / NifH для биосинтеза нитрогеназного кофактора FeMo» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 105 (33): 11679–8. DOI : 10.1073 / pnas.0803576105 . PMC 2575292 . PMID 18697927 .  
  15. ^ Яо, S; Mikkelsen, MJ. (2010). «Метаболическая инженерия для улучшения производства этанола в Thermoanaerobacter mathranii». Прикладная микробиология и биотехнология . 88 (1): 199–208. DOI : 10.1007 / s00253-010-2703-3 . PMID 20552355 .