Из Википедии, бесплатной энциклопедии
  (Перенаправлено с ДНК-зондов )
Перейти к навигации Перейти к поиску

В молекулярной биологии , A гибридизация зонд представляет собой фрагмент ДНК или РНК переменной длины (обычно 100-10000 основы длинного) , который может быть радиоактивно или флуоресцентно меченных. Затем его можно использовать в образцах ДНК или РНК для обнаружения присутствия нуклеотидных веществ (РНК-мишень), которые комплементарны последовательности в зонде. Таким образом, зонд гибридизуется с одноцепочечной нуклеиновой кислотой (ДНК или РНК), последовательность оснований которой позволяет создавать пары оснований зонд-мишень за счет комплементарности между зондом и мишенью. [1] Помеченный зонд сначала денатурируют (нагреванием илищелочные условия, такие как воздействие гидроксида натрия ) в одноцепочечную ДНК (оцДНК), а затем гибридизацию с целевой оцДНК ( Саузерн-блоттинг ) или РНК ( Нозерн-блоттинг ), иммобилизованной на мембране или in situ . Для обнаружения гибридизации зонда с его последовательностью-мишенью зонд маркируют (или «маркируют») молекулярным маркером либо радиоактивных, либо (в последнее время) флуоресцентных молекул; обычно используемые маркеры 32 Р (а радиоактивный изотоп из фосфора , включенный в фосфодиэфирных св зи в ДНК зонда) илидигоксигенин , который является нерадиоактивным маркером на основе антител . Последовательности ДНК или транскрипты РНК, которые имеют умеренное или высокое сходство последовательностей с зондом, затем обнаруживаются путем визуализации гибридизированного зонда с помощью авторадиографии или других методов визуализации. Обычно либо делается рентгеновский снимок фильтра, либо фильтр помещается в УФ-свет. Обнаружение последовательностей с умеренным или высоким сходством зависит от того, насколько жесткими были применены условия гибридизации - высокая строгость, такая как высокая температура гибридизации и низкая соль в гибридизационных буферах, допускает только гибридизацию между нуклеиновой кислотой.последовательности, которые очень похожи, тогда как низкая строгость, такая как более низкая температура и высокая соль, позволяет гибридизовать, когда последовательности менее похожи. Зонды для гибридизации, используемые в ДНК- микрочипах, относятся к ДНК, ковалентно прикрепленной к инертной поверхности, такой как стеклянные слайды с покрытием или генные чипы, с которыми гибридизируется мобильная кДНК-мишень.

В зависимости от метода зонд может быть синтезирован с использованием фосфорамидитного метода или он может быть создан и помечен с помощью ПЦР- амплификации или клонирования (оба являются более старыми методами). В целях повышения стабильности in vivo зонда РНК не используется. Вместо этого можно использовать аналоги РНК , в частности морфолинопроизводные . Зонды на основе молекулярной ДНК или РНК в настоящее время обычно используются при скрининге библиотек генов, обнаружении нуклеотидных последовательностей методами блоттинга и в других генных технологиях, таких как нуклеиновые кислоты и микроматрицы тканей .

Примеры зондов [ править ]

  • Датчики Scorpion®
  • Зонды Molecular Beacon
  • TaqMan ® зонды
  • Зонды LNA® (закрытая нуклеиновая кислота )
  • Технология Cycling Probe Technology (CPT)

Использование в микробной экологии [ править ]

В области микробной экологии олигонуклеотидные зонды используются для определения присутствия микробных видов, родов или микроорганизмов, классифицированных на более широком уровне, таких как бактерии , археи и эукариоты, посредством флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). [2] Зонды рРНК позволили ученым визуализировать микроорганизмы, которые еще предстоит культивировать в лабораторных условиях, путем извлечения последовательностей рРНК непосредственно из окружающей среды. [3] Примеры этих типов микроорганизмов включают:

  • Nevskia ramosa : N. ramosa - нейстонная бактерия, которая образует типичные дихотомически разветвленные розетки на поверхности мелководных пресноводных местообитаний. [4]
  • Achromatium oxaliferum : эта огромная бактерия (длина клеток до> 100 мкм, диаметр до 50 мкм) содержит глобулы серы и массивные включения кальцита и обитает в верхних слоях пресноводных отложений. Он виден невооруженным глазом и из-за своей устойчивости к выращиванию озадачил поколения микробиологов. [5]

Ограничения [ править ]

В некоторых случаях дифференциация между видами может быть проблематичной при использовании последовательностей 16S рРНК из-за сходства. В таких случаях 23S рРНК может быть лучшей альтернативой. [6] Глобальная стандартная библиотека последовательностей рРНК постоянно увеличивается и постоянно обновляется, и, следовательно, возможность случайной гибридизации между специально разработанным зондом (на основе полных и текущих данных от ряда тестовых организмов) и нежелательный / неизвестный организм-мишень не может быть легко отклонен. [7]Напротив, вполне вероятно, что существуют микроорганизмы, которые еще предстоит идентифицировать, которые филогенетически являются членами целевой группы зонда, но имеют частичные или почти идеальные сайты-мишени. обычно применяется при разработке зондов для конкретных групп.

Вероятно, самым большим практическим ограничением этого метода является отсутствие доступной автоматизации. [8]

Использование в судебной медицине [ править ]

В судебной медицине зонды гибридизации используются, например, для обнаружения участков с короткими тандемными повторами ( микросателлитных ) [9] и в методах полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ( RFLP ), которые широко используются как часть анализа профилей ДНК .

Ссылки [ править ]

  1. ^ «Гибридизации нуклеиновых кислот» . www.ndsu.edu . Проверено 26 мая 2017 .
  2. ^ Amann R, Людвиг W (2000). «Зонды нуклеиновых кислот, нацеленные на рибосомные РНК, для исследований в области микробной экологии» . FEMS Microbiology Reviews . 24 (5): 555–565. DOI : 10.1111 / j.1574-6976.2000.tb00557.x . PMID 11077149 . 
  3. ^ Amann, R .; Ludwig, W .; Шлейфер, К.-Х. (1995). «Филогенетическая идентификация и обнаружение in situ индивидуальных микробных клеток без культивирования» . Микробиологические обзоры . 59 : 143–169. DOI : 10.1128 / MMBR.59.1.143-169.1995 .
  4. ^ Glöckner, FO; Babenzien HD; Аманн Р. (1998). «Филогения и идентификация in situ Nevskia ramosa » . Прил. Environ. Microbiol . 64 (5): 1895–1901. DOI : 10,1128 / AEM.64.5.1895-1901.1998 .
  5. ^ Glöckner, FO; Babenzien HD; Аманн Р. (1999). «Филогения и разнообразие Achromatium oxaliferum ». Syst. Прил. Microbiol . 22 (1): 28–38. DOI : 10.1016 / s0723-2020 (99) 80025-3 . PMID 10188276 . 
  6. ^ Fox, GE; Wisotzkey, JD; Юртчук-младший, П. (1992). «Насколько близко близко: идентичность последовательности 16S рРНК может быть недостаточной для гарантии видовой идентичности» . Int. J. Syst. Бактериол . 42 (1): 166–170. DOI : 10.1099 / 00207713-42-1-166 . PMID 1371061 . 
  7. ^ Olsen, GJ; Лейн, диджей; Giovannoni, SJ; Pace, NR; Шталь Д.А. (1986). «Микробная экология и эволюция: подход рибосомной РНК». Анну. Rev. Microbiol . 40 : 337–365. DOI : 10.1146 / annurev.mi.40.100186.002005 . PMID 2430518 . 
  8. ^ Amann R, Людвиг W (2000). «Зонды нуклеиновых кислот, нацеленные на рибосомные РНК, для исследований в области микробной экологии» . FEMS Microbiology Reviews . 24 (5): 555–565. DOI : 10.1111 / j.1574-6976.2000.tb00557.x . PMID 11077149 . 
  9. ^ Титгат, Оливье. «Зонды STRide: пробы для идентификации коротких тандемных повторов с одной меткой». Биосенсоры и биоэлектроника . doi : https://doi.org/10.1016/j.bios.2021.113135 Проверить значение ( справка ) . |doi=