Из Википедии, свободной энциклопедии
  (Перенаправлен с флуоресцентных красок )
Перейти к навигации Перейти к поиску
Клетка человека, меченная флуорофором .

Флуорофор (или флуорохром , подобно хромофор ) представляет собой флуоресцентное химическое соединение , которое может повторно излучать свет при возбуждении света. Флуорофоры обычно содержат несколько объединенных ароматических групп или плоские или циклические молекулы с несколькими π-связями . [1]

Флуорофоры иногда используются сами по себе, как индикатор в жидкостях, как краситель для окрашивания определенных структур, как субстрат ферментов , или как зонд или индикатор (когда его флуоресценция зависит от факторов окружающей среды, таких как полярность или ионы). В более общем случае они ковалентно связаны с макромолекулой , служа маркером (или красителем, или меткой, или репортером) для аффинных или биоактивных реагентов ( антител , пептидов, нуклеиновых кислот). Флуорофоры, в частности, используются для окрашивания тканей, клеток или материалов в различных аналитических методах, например, при флуоресцентной визуализации и спектроскопии .

Флуоресцеин , через его амино-реактивное производное изотиоцианата флуоресцеина изотиоцианат (FITC), был одним из самых популярных флуорофоров. Начиная с маркировки антител, применение распространилось на нуклеиновые кислоты благодаря карбоксифлуоресцеину (FAM), TET, ...). Другие исторически распространенные флуорофоры - это производные родамина (TRITC), кумарина и цианина . [2] Новые поколения флуорофоров, многие из которых являются запатентованными, часто работают лучше, будучи более фотостабильными, яркими и / или менее чувствительными к pH, чем традиционные красители со сравнимым возбуждением и испусканием. [3] [4]

Флуоресценция [ править ]

Флуорофор поглощает световую энергию определенной длины волны и повторно излучает свет с большей длиной волны. Поглощенные длины волн , эффективность передачи энергии, и время до излучения зависят как от структуры флуорофора, так и от его химического окружения, поскольку молекула в возбужденном состоянии взаимодействует с окружающими молекулами. Длины волн максимального поглощения (≈ возбуждения) и излучения (например, поглощение / излучение = 485 нм / 517 нм) являются типичными терминами, используемыми для обозначения данного флуорофора, но весь спектр может быть важным для рассмотрения. Спектр длин волн возбуждения может быть очень узкой или более широкой полосой, или он может полностью выходить за пределы уровня отсечки. Спектр излучения обычно более резкий, чем спектр возбуждения, и имеет большую длину волны и, соответственно, меньшую энергию. Энергия возбуждения варьируется от ультрафиолета до видимого спектра , а энергия излучения может продолжаться от видимого света.в ближнюю инфракрасную область.

Основные характеристики флуорофоров:

  • Максимальная длина волны возбуждения и излучения (выраженная в нанометрах (нм)): соответствует пику в спектрах возбуждения и излучения (обычно по одному пику для каждого).
  • Молярный коэффициент поглощения (в молярном -1 см -1 ): связывает количество поглощенного света на данной длине волны с концентрацией флуорофора в растворе.
  • Квантовый выход : эффективность энергии, переданной от падающего света к испускаемой флуоресценции (= количество испускаемых фотонов на поглощенные фотоны).
  • Время жизни (в пикосекундах): продолжительность возбужденного состояния флуорофора перед возвращением в основное состояние. Это время, необходимое для того, чтобы популяция возбужденных флуорофоров распалась до 1 / e (≈0,368) от исходного количества.
  • Стоксов сдвиг : разница между максимальной длиной волны возбуждения и максимальной длиной волны излучения.
  • Темная фракция : доля молекул, активных в испускании флуоресценции. Для квантовых точек длительная микроскопия одиночных молекул показала, что 20-90% всех частиц никогда не излучают флуоресценции. [5] С другой стороны, наночастицы конъюгированного полимера (Pdots) почти не показывают темной фракции в своей флуоресценции. [6] Флуоресцентные белки могут иметь темную фракцию из-за неправильного свертывания белков или образования дефектных хромофоров. [7]

Эти характеристики определяют другие свойства, включая фотообесцвечивание или фоторезистентность (потеря флуоресценции при непрерывном возбуждении светом). Следует учитывать и другие параметры, так как полярность молекулы флуорофора, размер и форма флуорофора (например, для поляризационной флуоресценции ) и другие факторы могут изменить поведение флуорофоров.

Флуорофоры также можно использовать для гашения флуоресценции других флуоресцентных красителей (см. Статью « Тушение (флуоресценция)» ) или для передачи их флуоресценции на еще более длинной длине волны (см. Статью « Резонансная передача энергии Фёрстера» (FRET)).

Подробнее о принципе флуоресценции .

Размер (молекулярный вес) [ править ]

Большинство флуорофоров представляют собой небольшие органические молекулы из 20-100 атомов (200-1000 дальтон - молекулярная масса может быть выше в зависимости от привитых модификаций и конъюгированных молекул), но есть также гораздо более крупные природные флуорофоры, которые являются белками : зеленый флуоресцентный белок (GFP ) составляет 27 к Да и несколько фикобилипротеинов (PE, APC ...) являются ≈240k Da .

Флуоресцентные частицы, такие как квантовые точки : диаметром 2-10 нм, 100-100 000 атомов, также считаются флуорофорами. [8]

Размер флуорофора может стерически мешать меченной молекуле и влиять на полярность флуоресценции.

Семьи [ править ]

Флуоресценция различных веществ в УФ-свете. Зеленый - флуоресцеин, красный - родамин B, желтый - родамин 6G, синий - хинин, фиолетовый - смесь хинина и родамина 6g. Растворы имеют концентрацию около 0,001% в воде.

Молекулы флуорофоров можно использовать по отдельности или они могут служить флуоресцентным мотивом функциональной системы. Основываясь на молекулярной сложности и методах синтеза, молекулы флуорофоров обычно можно разделить на четыре категории: белки и пептиды, небольшие органические соединения, синтетические олигомеры и полимеры и многокомпонентные системы. [9] [10]

Флуоресцентные белки GFP (зеленый), YFP (желтый) и RFP (красный) могут быть присоединены к другим специфическим белкам с образованием гибридного белка , синтезируемого в клетках после трансфекции подходящего плазмидного носителя.

Небелковые органические флуорофоры принадлежат к следующим основным химическим семействам:

  • Производные ксантена : флуоресцеин , родамин , орегонский зеленый , эозин и техасский красный
  • Цианиновы производные: цианин, индодикарбоцианиновый , oxacarbocyanine , тиакарбоцианиновый и мероцианин
  • Производные скварейна и замещенные в кольцо скварины, включая красители Seta и Square
  • Производные скварин ротаксана : см. Красители тау.
  • Производные нафталина (производные дансила и продана )
  • Производные кумарина
  • Оксадиазола производные: pyridyloxazole , nitrobenzoxadiazole и benzoxadiazole
  • Производные антрацена : антрахиноны , включая DRAQ5, DRAQ7 и CyTRAK Orange
  • Производные пирена : каскадный синий и др.
  • Производные оксазина : нильский красный , нильский синий , крезиловый фиолетовый , оксазин 170 и др.
  • Акридиновые производные: профлавин , акридиновые оранжевый , акридиновые желтый и т.д.
  • Производные арилметина : аурамин , кристаллический фиолетовый , малахитовый зеленый
  • Производные тетрапиррола : порфин , фталоцианин , билирубин.
  • Производные дипиррометена: BODIPY , аза-BODIPY

Эти флуорофоры флуоресцируют из-за делокализованных электронов, которые могут перескакивать через полосу и стабилизировать поглощенную энергию. Например, бензол , один из простейших ароматических углеводородов, возбуждается при длине волны 254 нм и излучает при длине волны 300 нм. [11] Это отличает флуорофоры от квантовых точек, которые представляют собой флуоресцентные полупроводниковые наночастицы .

Они могут быть присоединены к белку к определенным функциональным группам, таким как - аминогруппы ( активный эфир , карбоксилат , изотиоцианат , гидразин ), карбоксильные группы ( карбодиимид ), тиол ( малеимид , ацетилбромид ), азид (с помощью химии щелчка или неспецифически ( глутаровый альдегид )).

Кроме того, могут присутствовать различные функциональные группы для изменения его свойств, таких как растворимость, или придания особых свойств, таких как бороновая кислота, которая связывается с сахарами, или множественные карбоксильные группы для связывания с определенными катионами. Когда краситель содержит электронодонорную и электроноакцепторную группы на противоположных концах ароматической системы, этот краситель, вероятно, будет чувствителен к полярности окружающей среды ( сольватохромный ), поэтому его называют чувствительным к среде. Часто внутри клеток используются красители, непроницаемые для заряженных молекул, в результате чего карбоксильные группы превращаются в сложный эфир, который удаляется эстеразами внутри клеток, например фура-2АМ и флуоресцеиндиацетатом .

Следующие семейства красителей являются группами товарных знаков и не обязательно имеют структурное сходство.

  • Краситель CF (Biotium)
  • Зонды DRAQ и CyTRAK (BioStatus)
  • BODIPY ( Invitrogen )
  • EverFluor ( Setareh Biotech)
  • Алекса Флуор (Invitrogen)
  • Белла Флуор (Setareh Biotech)
  • DyLight Fluor (Thermo Scientific, Pierce)
  • Атто и Трейси ( Сигма Олдрич )
  • Флюо-зонды ( Interchim )
  • Красители Аббериор (Abberior)
  • Красители DY и MegaStokes (Dyomics)
  • Красители Sulfo Cy (Cyandye)
  • HiLyte Fluor (АнаСпек)
  • Красители Seta, SeTau и Square (SETA BioMedicals)
  • Красители Quasar и Cal Fluor ( Biosearch Technologies )
  • SureLight Красители ( APC , ПЭС PerCP , Фикобилисома ) (Columbia Biosciences)
  • APC, APCXL, RPE, BPE (Phyco-Biotech, Greensea, Prozyme, Flogen)
  • Красители Вио (Miltenyi Biotec)
Ядра эндотелиальных клеток легочной артерии крупного рогатого скота, окрашенные в синий цвет с помощью DAPI , митохондрии, окрашенные в красный цвет с помощью MitoTracker Red CMXRos, и F-актин, окрашенные в зеленый цвет с помощью фаллоидина Alexa Fluor 488 и отображенные на флуоресцентном микроскопе.

Примеры часто встречающихся флуорофоров [ править ]

Реактивные и конъюгированные красители [ править ]

Сокращения:

  • Ex (нм): длина волны возбуждения в нанометрах.
  • Em (нм): длина волны излучения в нанометрах.
  • MW: молекулярный вес
  • QY: квантовый выход

Красители нуклеиновых кислот [ править ]

Красители для функций клеток [ править ]

Флуоресцентные белки [ править ]

Сокращения:

  • Ex (нм): длина волны возбуждения в нанометрах.
  • Em (нм): длина волны излучения в нанометрах.
  • MW: молекулярный вес
  • QY: квантовый выход
  • BR: Яркость: молярный коэффициент поглощения * квантовый выход / 1000
  • PS: Фотостабильность : время [сек] для уменьшения яркости на 50%

Приложения [ править ]

Флуорофоры имеют особое значение в области биохимии и исследований белков , например, в иммунофлуоресценции, но также и в анализе клеток [13], например, в иммуногистохимии [3] [14] и сенсорах малых молекул . [15] [16]

Используется вне наук о жизни [ править ]

Кроме того, флуоресцентные красители находят широкое применение в промышленности под названием «неоновые цвета», такие как:

  • Многотонное использование в крашении текстиля и оптических отбеливателях в стиральных порошках
  • Продвинутые косметические составы; защитное снаряжение и одежда
  • Органические светодиоды (OLED)
  • Изобразительное искусство и дизайн (плакаты и картины)
  • Синергисты инсектицидов и экспериментальных препаратов
  • В качестве красителя в хайлайтерах для придания сияющего эффекта
  • Солнечные панели для сбора большего количества света / длин волн

См. Также [ править ]

  • Категория: Флуоресцентные красители
  • Флуоресценция в науках о жизни
  • Тушение флуоресценции
  • Восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP) - приложение для количественной оценки подвижности молекул в липидных бислоях .

Ссылки [ править ]

  1. ^ Хуан Карлос Стокерт, Альфонсо Бласкес-Кастро (2017). «Глава 3 Красители и флуорохромы» . Флуоресцентная микроскопия в науках о жизни . Издательство Bentham Science. С. 61–95. ISBN 978-1-68108-519-7. Проверено 24 декабря 2017 года .
  2. ^ Rietdorf J (2005). Микроскопические методы . Достижения в области биохимической инженерии / биотехнологии. Берлин: Springer. С. 246–9. ISBN 3-540-23698-8. Проверено 13 декабря 2008 .
  3. ^ a b Цзянь Р.Ю .; Ваггонер А (1995). «Флуорофоры для конфокальной микроскопии» . В Pawley JB (ред.). Справочник по биологической конфокальной микроскопии . Нью-Йорк: Пленум Пресс. С. 267–74. ISBN 0-306-44826-2. Проверено 13 декабря 2008 .
  4. ^ Lakowicz, JR (2006). Принципы флуоресцентной спектроскопии (3-е изд.). Springer. п. 954. ISBN 978-0-387-31278-1.
  5. ^ Pons T, Medintz IL, Farrell D, Ван X, Граймс AF, английский DS, Берти L, Mattoussi H (2011). «Исследования колокализации одиночных молекул проливают свет на идею полного излучения по сравнению с одиночными темными квантовыми точками». Маленький . 7 (14): 2101–2108. DOI : 10.1002 / smll.201100802 . PMID 21710484 . 
  6. ^ Koner AL, Крндийя D, Hou Q, Sherratt DJ, Хоуарт M (2013). «Наночастицы сопряженных полимеров с концевыми гидроксильными группами имеют яркую фракцию, близкую к единице, и обнаруживают холестерин-зависимую зависимость нанодоменов IGF1R» . САУ Нано . 7 (2): 1137–1144. DOI : 10.1021 / nn3042122 . PMID 23330847 . 
  7. ^ Гарсиа-Parajo М.Ф., Сегерс-Nolten Г.М., Веерман JA, Греве Дж, ван Хюльст NF (2000). «Управляемая светом динамика флуоресцентного излучения в отдельных зеленых флуоресцентных белковых молекулах в реальном времени» . PNAS . 97 (13): 7237–7242. DOI : 10.1073 / pnas.97.13.7237 . PMID 10860989 . 
  8. ^ J. Mater. Chem. С, 2019, 7, 12373. Цитировать журнал требует |journal=( помощь );Отсутствует или пусто |title=( справка )CS1 maint: multiple names: authors list (link)
  9. ^ Лю, J .; Liu, C .; He, W. (2013), "Флуорофоры и их применение в качестве молекулярных зондов в живых клетках", Curr. Орг. Chem. , 17 (6): 564-579, DOI : 10,2174 / 1385272811317060003
  10. ^ Хуан Карлос Стокерт, Альфонсо Бласкес-Кастро (2017). «Глава 4 Флуоресцентные этикетки» . Флуоресцентная микроскопия в науках о жизни . Издательство Bentham Science. С. 96–134. ISBN 978-1-68108-519-7. Проверено 24 декабря 2017 года .
  11. ^ Omlc.ogi.edu
  12. ^ a b c d e Columbia Biosciences
  13. ^ Сирбу, Думитру; Лули, Саймир; Лесли, Джек; Окли, Фиона; Беннистон, Эндрю С. (2019). «Улучшенная оптическая визуализация in vivo воспалительного ответа на острое повреждение печени у мышей C57BL / 6 с использованием очень яркого красителя BODIPY в ближнем инфракрасном диапазоне». ChemMedChem . 14 (10): 995–999. DOI : 10.1002 / cmdc.201900181 . ISSN 1860-7187 . PMID 30920173 .  
  14. ^ Таки, Масаясу (2013). «Глава 5. Визуализация и определение кадмия в клетках». В Астрид Сигель; Гельмут Сигель; Роланд К.О. Сигель (ред.). Кадмий: от токсикологии к сущности . Ионы металлов в науках о жизни. 11 . Springer. С. 99–115. DOI : 10.1007 / 978-94-007-5179-8_5 . PMID 23430772 . 
  15. ^ Сирбу, Думитру; Мясник, Джон Б.; Waddell, Paul G .; Андраш, Питер; Беннистон, Эндрю С. (18.09.2017). "Локально возбужденные красители, связанные с переносом заряда, в качестве оптически чувствительных нейронных пробников" (PDF) . Химия - европейский журнал . 23 (58): 14639–14649. DOI : 10.1002 / chem.201703366 . ISSN 0947-6539 . PMID 28833695 .   
  16. ^ Цзян, Сицянь; Ван, Линфэй; Кэрролл, Шайна Л .; Чен, Цзяньвэй; Wang, Meng C .; Ван, Цзинь (20.08.2018). «Проблемы и возможности малых молекул флуоресцентных зондов в окислительно-восстановительной биологии» . Антиоксиданты и редокс-сигналы . 29 (6): 518–540. DOI : 10.1089 / ars.2017.7491 . ISSN 1523-0864 . PMC 6056262 . PMID 29320869 .   

Внешние ссылки [ править ]

  • База данных флуоресцентных красителей [ постоянная мертвая ссылка ]
  • Таблица флуорохромов
  • Справочник по молекулярным зондам - исчерпывающий ресурс по флуоресцентной технологии и ее приложениям.