Лизат амебоцитов Limulus ( LAL ) представляет собой водный экстракт клеток крови ( амебоцитов ) атлантического подковообразного краба Limulus polyphemus . LAL реагирует с липополисахаридом бактериального эндотоксина (LPS), который является мембранным компонентом грамотрицательных бактерий . Эта реакция лежит в основе теста LAL , который широко используется для обнаружения и количественного определения бактериальных эндотоксинов .
В Азии вместо этого иногда используется аналогичный тест Tachypleus amebocyte lysate ( TAL ), основанный на местных подковообразных крабах Tachypleus gigas или Tachypleus tridentatus . [1] Анализ рекомбинантного фактора C (rFC) представляет собой замену LAL / TAL на основе аналогичной реакции. [2]
Задний план
В 1956 году Фред Банг сообщил, что грамотрицательные бактерии, даже если их убить, превратят кровь подковообразного краба в полутвердую массу. Позже было обнаружено, что клетки крови животного, мобильные клетки, называемые амебоцитами , содержат гранулы с фактором свертывания крови, известным как коагулоген ; он высвобождается за пределы клетки при обнаружении бактериального эндотоксина. Получающаяся в результате коагуляция (гелеобразование), как полагают, сдерживает бактериальные инфекции в полузакрытой системе кровообращения животного . [3] Современный анализ лизата привел к пониманию этой каскадной системы, в которой несколько ферментов работают последовательно для получения геля. Точкой входа для свертывания, вызванного эндотоксинами, является фактор свертывания крови Limulus C. [4]
В 1977 году Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) одобрило LAL для тестирования лекарств, продуктов и устройств, контактирующих с кровью. До этого для этой цели использовался гораздо более медленный и более дорогой тест на кроликах . [5]
Собирают подковообразных крабов и удаляют кровь из перикарда подковообразных крабов ; крабов возвращают в воду. Производители LAL измерили уровень смертности обескровленных крабов на уровне 3%; однако недавние исследования показывают, что это число может быть ближе к 15% [6] или даже 30%. [7] Клетки крови отделяются от сыворотки с помощью центрифугирования и затем помещаются в дистиллированную воду, в результате чего они набухают и лопаются («лизируются»). Это высвобождает химические вещества изнутри клетки («лизат»), который затем очищается и лиофилизируется . Чтобы проверить образец на эндотоксины, его смешивают с лизатом и водой; эндотоксины присутствуют, если происходит коагуляция. [8]
LAL тест
Существует три основных метода: гель-сгусток, турбидиметрический и хромогенный. Основное применение LAL - это тестирование парентеральных фармацевтических препаратов и медицинских устройств, контактирующих с кровью или спинномозговой жидкостью . В Соединенных Штатах FDA опубликовало руководство по валидации теста LAL в качестве теста на эндотоксин для таких продуктов. [9]
ЛАЛ каскад также запускается (1,3) -β-D - глюкана , с помощью другого фактора G. Оба бактериальные эндотоксины и (1,3) -β-D-глюкана, считаются патоген-ассоциированные молекулярные структуры , или PAMPs , вещества, которые вызывают воспалительные реакции у млекопитающих . [10]
Преодоление торможения и усиления
Одним из наиболее трудоемких аспектов тестирования эндотоксинов с использованием LAL является предварительная обработка образцов для преодоления ингибирования анализа, которое может помешать тесту LAL, так что это влияет на восстановление эндотоксина. Если тестируемый продукт вызывает меньшее извлечение эндотоксина, чем ожидалось, продукт ингибирует тест LAL. Продукты, которые вызывают более высокие, чем ожидалось, значения являются улучшенными. Преодоление ингибирующих и усиливающих свойств продукта требуется FDA как часть валидации теста LAL для использования в окончательном тестировании выпуска инъекционных препаратов и медицинских устройств. Правильное восстановление эндотоксина должно быть доказано, прежде чем LAL можно будет использовать для выпуска продукта. [11]
Альтернативы
Рекомбинантный фактор C
LAL-тест является основным источником зависимости от продуктов животного происхождения в биомедицинской промышленности и представляет собой вызов трем научным принципам в отношении использования животных в тестировании. В связи с сообщениями о более высоком, чем ожидалось, уровне смертности [7] было сочтено более этичным разработать альтернативы тесту. [12] Идея о том, что отход от LAL для сокращения использования атлантических подковообразных крабов поможет усилиям по сохранению, должна быть тщательно оценена, поскольку переход на rFC может привести к контрпродуктивным эффектам, поставив под угрозу усилия по сохранению, которые многие боролись за реализацию [ необходима цитата ] . С 2003 года коммерчески доступен синтетический заменитель теста LAL. Названный анализом рекомбинантного фактора C (rFC), он основан на том же белке фактора свертывания крови Limulus , который продуцируется генетически модифицированными организмами, такими как клетки кишечника насекомых. (Конкретная используемая последовательность фактора C не обязательно происходит от атлантического подковообразного краба.) [5]
Вместо имитации всего пути свертывания крови, тесты rFC позволяют фактору C расщеплять флуорогенную молекулу, так что образец загорается, когда эндотоксин активирует фактор. Поскольку он не содержит фактора G, (1,3) -β-D-глюкан не вызывает ложноположительных результатов . По состоянию на 2018 год имеющиеся данные показывают, что тест rFC не хуже теста LAL. [13]
Внедрение теста rFC шло медленно, и ситуация начала меняться в 2012 году, когда FDA США и европейское министерство здравоохранения признали его приемлемой альтернативой. Отсутствие упоминания о нем в Фармакопеях оставалось проблемой, поскольку не существовало хорошего стандарта для запуска теста в производственной среде. [13] В 2016 году он был добавлен в Европейскую фармакопею . [5] Патент на RFC также был ограничен до истечения срока его действия в 2018 году. [13]
1 июня 2020 года Фармакопея США (USP) решила отменить предложение о включении рекомбинантной технологии для тестирования эндотоксинов в главу <85> Бактериальные эндотоксины и начать разработку отдельной главы, которая расширяет использование, проверку и сопоставимость эндотоксиновые тесты на основе рекомбинантно полученных реагентов. USP предложила отдельное руководство, содержащее только главу 1085.1, хотя комментарии и отзывы, опубликованные 11 декабря 2020 года, показывают, что фармацевтические компании и FDA не поддерживают эту главу и запрашивают статус справочника. [14]
Тест активации моноцитов
Тест активации моноцитов (MAT) - еще один предложенный метод тестирования на эндотоксины на основе моноцитов в крови человека . Он измеряет высвобождение цитокинов из них из-за присутствия пирогенов , в основном отражая процесс, посредством которого эти токсины вызывают лихорадку у людей (и кроликов, как в первоначальном тесте на пирогены). [15] Протокол теста MAT с использованием культивированных клеток описан в Европейской фармакопее. [16]
Смотрите также
- Фермент свертывания крови Limulus
- Липополисахарид
Рекомендации
- Перейти ↑ Sheng J, Zhou J, Peng Y, Zhu Z, Chen L (1 января 2006 г.). «Тест с использованием лизата тахиплеуса амебоцитов в реакции переливания» . Китайский журнал нозокомиологии (на китайском языке).
- ^ "Производители и консервация эндотоксинов" . www.horseshoecrab.org . Проверено 10 марта 2020 .
- ^ Грир С. «Фредерик Банг» . Школа общественного здравоохранения JH Bloomberg . Школа общественного здравоохранения Bloomberg Джонса Хопкинса.
- ^ Иванага С. (май 2007 г.). «Биохимический принцип теста Limulus для определения бактериальных эндотоксинов» . Труды Японской академии. Серия B, Физические и биологические науки . 83 (4): 110–9. Bibcode : 2007PJAB ... 83..110I . DOI : 10,2183 / pjab.83.110 . PMC 3756735 . PMID 24019589 .
- ^ а б в Чжан С. (9 мая 2018 г.). «Последние дни урожая голубой крови» . Атлантика . Проверено 15 мая 2018 .
- ^ «Катастрофа: Повесть о двух видах - преимущества голубой крови» . PBS. 10 июня 2008 г.
- ^ а б Leschen AS, Correia SJ (март 2010 г.). «Смертность самок подковообразных крабов (Limulus polyphemus) в результате биомедицинского кровотечения и обработки: последствия для управления рыболовством» (PDF) . Поведение и физиология морских и пресноводных водоемов . 43 (2): 135–47. DOI : 10.1080 / 10236241003786873 . S2CID 35152647 . Архивировано 14 июня 2010 года из оригинального (PDF) .
- ^ «История Limulus и эндотоксина» . Морская биологическая лаборатория . Архивировано из оригинального 28 октября 2008 года.
- ^ «Руководство для промышленности: Тестирование на пирогены и эндотоксины: вопросы и ответы» . Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США . Проверено 5 марта 2019 .
- ^ Sandle T (август 2013 г.). «Примеси в фармацевтической продукции: с учетом бета-глюканов». Американский фармацевтический обзор . 16 (5 Дополнение S1): 16–19.
- ^ Уильямс К.Л., изд. (2007). Эндотоксины пирогены, LAL-тестирование и депирогенизация (3-е изд.). Нью-Йорк: Informa Healthcare. п. 342. ISBN. 978-1420020595. Проверено 7 марта 2015 года .
Правильное восстановление эндотоксина должно быть доказано, прежде чем LAL можно будет использовать для выпуска продукта.
- ^ Горман, Ричард (2020). «Атлантические подковообразные крабы и тестирование на эндотоксины: перспективы альтернатив, устойчивые методы и 3R (замена, сокращение и уточнение)» . Границы морских наук . 7 . DOI : 10.3389 / fmars.2020.582132 . ISSN 2296-7745 .
- ^ а б в Мэлони Т., Фелан Р., Симмонс Н. (октябрь 2018 г.). «Спасение подковообразного краба: синтетическая альтернатива крови подковообразного краба для обнаружения эндотоксинов» . PLOS Биология . 16 (10): e2006607. DOI : 10.1371 / journal.pbio.2006607 . PMC 6200278 . PMID 30312293 .
- ^ https://www.uspnf.com/sites/default/files/usp_pdf/EN/USPNF/usp-nf-notices/1085-1-pf-comments-20201211.pdf
- ^ «Альтернативные методы тестирования эндотоксинов» . www.horseshoecrab.org .
- ^ «Тест активации моноцитов: от валидации до лабораторного тестирования GMP» . Американский фармацевтический обзор .
Внешние ссылки
- Horsehoecrab.org
- LAL Обновление
- Продукт для обнаружения эндотоксинов
- Руководство по испытаниям FDA LAL 1987 г.
- Реагенты LAL Test