Копирование шпильки на роликах

Репликация с вращающейся шпилькой ( RHR ) - это однонаправленная форма репликации ДНК со смещением цепей, используемая парвовирусами, группой вирусов, которые составляют семейство Parvoviridae . Парвовирусы имеют геномы линейной одноцепочечной ДНК (оцДНК), в которых кодирующая часть генома фланкирована теломерами на каждом конце, которые образуют шпильки . Во время RHR эти шпильки многократно разворачиваются и повторно складываются, чтобы изменить направление репликации ДНК, так что репликация непрерывно прогрессирует взад и вперед по геному. RHR инициируется и завершается эндонуклеазой, кодируемой парвовирусами, которую по-разному называют NS1 или Rep, и RHR аналогиченРепликация по кругу , которая используется вирусами оцДНК с кольцевыми геномами.

Перед началом RHR ДНК-полимераза клетки- хозяина преобразует геном в дуплексную форму, в которой кодирующая часть является двухцепочечной и соединена с концевыми шпильками. Оттуда информационная РНК (мРНК), кодирующая вирусный инициаторный белок, транскрибируется и транслируется для синтеза белка. Белок-инициатор запускает RHR, связываясь с геномом в области, прилегающей к шпильке, называемой ориджином, и устанавливая вилку репликации с помощью своей геликазы.Мероприятия. Надрезание приводит к тому, что шпилька раскладывается в линейную вытянутую форму. Затем теломеры реплицируются, и обе нити теломер снова складываются в свои исходные формы поворота. Это перемещает вилку репликации, чтобы переключить шаблоны на другую цепь и двигаться в противоположном направлении. При достижении другого конца происходит тот же процесс разворачивания, репликации и рефолдинга.

Парвовирусы различаются по тому, одинаковые или разные шпильки. Гомотеломерные парвовирусы, такие как аденоассоциированные вирусы (AAV), то есть те, которые имеют идентичные или похожие теломеры, имеют оба конца, реплицируемые с помощью терминального разрешения, ранее описанного процесса. Гетеротеломерные парвовирусы, такие как крошечный вирус мышей (MVM), то есть те, которые имеют разные теломеры, имеют один конец репликации с помощью терминального разрешения, а другой - с помощью асимметричного процесса, называемого разрешением соединения. При разрешении асимметричного соединения дуплексная протяженная форма теломеры реорганизуется в соединение крестообразной формы., и правильная ориентация теломер воспроизводится от нижнего плеча крестообразной формы. В результате RHR синтезируется репликативная молекула, содержащая многочисленные копии геномов. Белок-инициатор периодически вырезает геномы потомства оцДНК из этого репликативного конкатемера.

Фон [ править ]

Парвовирусы - это семейство ДНК-вирусов , геномы которых имеют одноцепочечную ДНК (оцДНК), заключенную в прочные икосаэдрические белковые капсиды диаметром 18–26 нанометров (нм). ^[1] В отличие от большинства других вирусов оцДНК, которые имеют кольцевые геномы, образующие петлю, парвовирусы имеют линейные геномы с короткими концевыми последовательностями на каждом конце генома. Эти концы могут быть сформированы в структуры, называемые шпильками или петлями шпильки, и состоят из коротких несовершенных палиндромов. ^{[2] [3] В} зависимости от вируса кодирующая область генома имеет длину 4–6 килобаз (т.п.н.), а каждый конец составляет 116–550 нуклеотидов (нуклеотидов). Последовательности шпильки обеспечивают большую часть цис-действующая информация, необходимая для репликации и упаковки ДНК. ^{[1] [4]}

Геномы парвовирусов могут быть как с положительным, так и с отрицательным смыслом . Некоторые виды, такие как аденоассоциированные вирусы (AAV), такие как AAV2, упаковывают примерно равное количество положительно-смысловых и отрицательно-смысловых цепей в вирионы, другие, такие как мельчайший вирус мышей (MVM), предпочитают упаковывать отрицательные - чувственные нити, а другие имеют разные пропорции. ^[4] Из-за этого несоответствия 5'-конец (обычно произносится как «пять простых концов») цепи, кодирующей неструктурные белки, называется «левым концом», а 3'-конец (обычно произносится « три простых конца ») называется« правым концом ». ^[3] Что касается нити с отрицательным смыслом, 3'-конец - это левая сторона, а 5'-конец - правая сторона. ^{[4] [5]}

Парвовирусы реплицируют свои геномы посредством процесса, называемого репликацией шпильки (RHR), который представляет собой однонаправленную форму репликации ДНК со смещением цепей. Перед репликацией кодирующая часть генома оцДНК преобразуется в форму двухцепочечной ДНК (дцДНК), которая затем расщепляется вирусным белком для инициации репликации. Последовательное разворачивание и повторная укладка концов шпильки изменяет направление синтеза, что позволяет репликации перемещаться вперед и назад по геному, чтобы синтезировать непрерывную дуплексную репликативную форму (RF) промежуточного звена ДНК. Геномы потомства оцДНК затем вырезают из интермедиата RF. ^{[4] [6]} Хотя общие аспекты RHR сохраняются для разных родов и видов, точные детали, вероятно, различаются. ^[7]

Геномы парвовирусов имеют отличные отправные точки репликации, которые содержат последовательности палиндромной ДНК. Эти последовательности способны чередоваться между спариванием оснований между нитями и внутри нитей на протяжении репликации, и они служат самопрайминг-теломерами на каждом конце генома. ^[2] Они также содержат два ключевых сайта, необходимых для репликации, используемых белком-инициатором: сайт связывания и сайт расщепления. ^[8] Последовательности теломер обладают значительной сложностью и разнообразием, что позволяет предположить, что они выполняют дополнительные функции для многих видов. ^{[1] [9]} В MVM, например, шпилька на левом конце содержит сайты связывания для факторов транскрипции, которые модулируют экспрессию гена от соседнего промотора.. Для AAV шпильки могут связываться с комплексами MRE11 / Rad50 / NBS1 (MRN) и гетеродимерами Ku70 / 80, которые участвуют в распознавании и восстановлении ДНК. ^[5] В целом, однако, они имеют одинаковую базовую структуру: несовершенные палиндромы, в которых полностью или преимущественно спаренная по основанию область оканчивается осевой симметрией. Эти палиндромы могут складываться в различные структуры, такие как Y-образная структура и крестообразная структура. Во время репликации концы действуют как шарниры, в которых неидеально спаренные основания или частично крестообразные области, окружающие ось, создают благоприятную среду для разворачивания и повторного сворачивания шпильки. ^{[2] [3] [4]}

Некоторые парвовирусы, такие как AAV2, являются гомотеломерными, что означает, что две палиндромные теломеры похожи или идентичны и образуют часть более крупных (инвертированных) последовательностей концевых повторов ((I) TR). Таким образом, репликация на каждом оконечном конце аналогична. Другие парвовирусы, такие как MVM, являются гетеротеломерами, что означает, что они имеют две физически разные теломеры. В результате гетеротеломерные парвовирусы, как правило, имеют более сложный процесс репликации, поскольку два теломера имеют разные процессы репликации. ^{[2] [3] [4]} В общем, гомотеломерные парвовирусы реплицируют оба конца с помощью процесса, называемого конечным разрешением, тогда как гетеротеломерные парвовирусы реплицируют один конец с помощью терминального разрешения, а другой конец - с помощью асимметричного процесса, называемого разрешением соединения. ^{[4] [5][6] [10] В} следующей таблице показано, является ли род гетеро- или гомотеломерным, а также другие геномные характеристики. ^[4]

Общий процесс [ править ]

Весь процесс репликации «шпильки», который имеет отдельные последовательные стадии, можно резюмировать следующим образом: ^{[4] [5] [7]}

• 1. Кодирующая часть генома реплицируется, начиная с 3'-конца 3'-шпильки, которая действует как праймер , и продолжается до тех пор, пока вновь синтезированная цепь не соединится с 5'-концом 5'-шпильки. , производя дуплексную молекулу ДНК, которая имеет две цепи кодирующей части генома.
• 2. мРНК, кодирующая белок инициатора репликации вируса, транскрибируется и затем транслируется для синтеза белка.
• 3. Белок-инициатор связывается с ДНК и расщепляет ее в области, называемой источником, в результате чего шпилька разворачивается в линейную вытянутую форму. В то же время белок-инициатор создает вилку репликации за счет своей геликазной активности.
• 4. Шпилька расширенной формы реплицируется для создания перевернутой копии теломеры на вновь синтезированной нити.
• 5. Две нити этого конца снова складываются в две шпильки, которые меняют положение репликационной вилки для переключения шаблонов и перемещения в противоположном направлении.
• 6. Репликация ДНК продолжается линейным образом от одного конца до другого с использованием противоположной цепи в качестве матрицы.
• 7. Достигнув другого конца, шпилька на этом конце разворачивается и снова складывается, чтобы воспроизвести конец, и еще раз поменять местами шаблоны и изменить направление репликации. Эта прямая и обратная репликация постоянно повторяется, создавая конкатемер нескольких копий генома.
• 8. Белок вирусного инициатора периодически вырезает отдельные геномные цепи ДНК из репликативного конкатемера.
• 9. Вырезанные геномы оцДНК упаковываются во вновь сконструированные вирусные капсиды.

Подготовка к репликации [ править ]

При входе в клетку связка длиной около 24 нуклеотидов, которая прикрепляет вирусный белок NS1, необходимый для репликации, к вириону, отщепляется от вириона, чтобы присоединиться позже. ^[3] После проникновения в клетку вирионы накапливаются в ядре клетки, в то время как геном все еще находится внутри капсида. Эти капсиды могут быть переконфигурированы в открытое или переходное состояние во время входа. Точный механизм, с помощью которого геном покидает капсид, неясен. ^[9] Для AAV было высказано предположение, что ядерные факторы разбирают капсид, тогда как для MVM это выглядит так, как будто геном выбрасывается в направлении 3'-к-5 'из отверстия в капсиде, называемого порталом. ^[5]

У парвовирусов отсутствуют гены, способные заставить покоящиеся клетки перейти в фазу синтеза ДНК (S-фаза). Кроме того, голая оцДНК может быть нестабильной, восприниматься клеткой-хозяином как чужеродная или неправильно реплицироваться при репарации ДНК хозяина . По этим причинам геном должен быть либо быстро преобразован в его менее обструктивную, более стабильную дуплексную форму, либо удерживаться внутри капсида до тех пор, пока он не станет непокрытым во время S-фазы. Обычно происходит последнее, и вирион остается молчаливым в ядре до тех пор, пока клетка-хозяин сама не переходит в S-фазу. В течение этого периода ожидания вирионы могут использовать определенные стратегии, чтобы уклоняться от защитных механизмов хозяина, чтобы защитить свои шпильки и ДНК для достижения S-фазы ^[9], хотя неясно, как это происходит. ^[4]Поскольку геном упакован как оцДНК, создание комплементарной цепи необходимо до экспрессии гена . ^{[5] [9]}

ДНК-полимеразы способны синтезировать ДНК только в направлении от 5 'к 3', и для начала синтеза им требуется праймер пары оснований. Парвовирусы устраняют эти ограничения, используя свои концы в качестве праймеров для синтеза комплементарной цепи. ^[9] 3'-гидроксильный конец левого (3 ') конца соединяется с внутренним основанием для инициации начального синтеза ДНК, что приводит к преобразованию генома оцДНК в его первую дуплексную форму. ^{[1] [7]}Это мономерная двухцепочечная молекула ДНК, в которой две цепи ковалентно сшиты друг с другом на левом конце одной копией вирусной теломеры. Синтез дуплексной формы предшествует экспрессии NS1, поэтому, когда репликационная вилка во время синтеза начальной комплементарной цепи достигает правого (5 ') конца, она не смещает и не копирует шпильку на правом конце. Это позволяет лигазе хозяина ковалентно лигировать 3'-конец новой цепи ДНК с 5'-концом правой шпильки, тем самым создавая дуплексную молекулу. На этом этапе ресинтезируется связующая последовательность, которая присутствовала до проникновения вируса в клетку. ^[6]

Основные вирусные белки и инициация [ править ]

Как только инфицированная клетка входит в S-фазу, геномы парвовирусов преобразуются в свою дуплексную форму с помощью аппарата репликации хозяина, и мРНК, кодирующая неструктурные (NS) белки, транскрибируется, начиная с вирусного промотора (P4 для MVM). ^{[4] [5] [9]} Один из этих белков NS обычно называется NS1, но также Rep1 или Rep68 / 78 для рода Dependoparvovirus , к которому принадлежит AAV. ^[4] NS1 представляет собой сайт-специфический ДНК-связывающий белок, который действует как белок инициатора репликации ^{[9] за} счет активности никазы. ^[15] Он также опосредует удаление обоих концов генома из дуплексных RF-интермедиатов посредством переэтерификации.реакция, которая вводит ник в определенные последовательности дуплексного происхождения. ^[4] компонента Ключа NS1 включает в себя домен HUH эндонуклеазы в направлении N-конца белка и 3 надсемейства (SF3) геликазов по направлению к С-конца , ^[16] , а также активность АТФазы. ^[1] Он связывается с оцДНК, РНК и сайт-специфично на дуплексной ДНК при повторении тетрануклеотидной последовательности 5'-ACCA-3 ' _1-3 . ^{[1] [9]} Эти последовательности присутствуют в сайтах ориджина репликации вируса и повторяются во многих сайтах по всему геному в более или менее дегенеративных формах. ^[15]

NS1 разрывает ковалентно закрытый правый конец теломеры посредством реакции переэтерификации, которая высвобождает спаренный по основанию 3'-нуклеотид в виде свободного гидроксила (-ОН). ^[4] Этой реакции способствует ДНК-связывающий белок хозяина из семейства высокоподвижных групп 1/2 (HMG1 / 2), который осуществляется в ориджине репликации, OriR , который был создан последовательностями в правой части и непосредственно примыкающей к ней. шпилька. Левый конец теломер MVM, гетеротеломерного парвовируса, содержит последовательности, которые могут давать начало репликации в промежуточных дуплексах более высокого порядка, но эти последовательности неактивны на шпильке-конце мономерной молекулы, поэтому NS1 всегда инициирует репликацию справа. конец. ^[6]

3'-ОН, который высвобождается за счет надреза, действует как праймер для ДНК-полимеразы, чтобы начать синтез комплементарной цепи ^{[8], в} то время как NS1 остается ковалентно прикрепленным к 5'-концу через остаток тирозина . ^[1] Следовательно, копия NS1 остается прикрепленной к 5'-концу всей RF и ДНК потомства на протяжении репликации, упаковки и высвобождения вириона. ^{[4] [6]} NS1 способен связываться с этим конкретным сайтом только путем сборки в гомодимеры или мультимеры более высокого порядка, что происходит естественным образом при добавлении аденозинтрифосфата (АТФ), который, вероятно, опосредуется геликазным доменом NS1. В естественных условияхисследования показали, что NS1 может образовывать множество олигомерных состояний, но, скорее всего, он собирается в гексамеры, чтобы выполнять функции как эндонуклеазного домена, так и геликазного домена. ^[15]

Считается, что, начиная с местоположения в нике, NS1 организует репликационную вилку и действует как репликативная 3'-к-5'-геликаза. Рядом со своим C-концом NS1 содержит кислый домен активации транскрипции. Этот домен действует, повышая регуляцию транскрипции, начиная с вирусного промотора (P38 для MVM), когда NS1 связывается с серией 5'-ACCA-3 'мотивов, называемой последовательностью tar , расположенной выше (к 5'-концу) промоторной единицы, а также посредством взаимодействия с NS1 и различными факторами транскрипции. ^[15] NS1 также рекрутирует комплекс клеточного белка репликации A (RPA), который необходим для создания новой репликационной вилки, а также для связывания и стабилизации смещенных одиночных цепей. ^[6]

Хотя NS1 является единственным неструктурным белком, необходимым для всех парвовирусов, у некоторых есть другие индивидуальные белки, которые необходимы для репликации. Для MVM NS2, по-видимому, перепрограммирует клетку-хозяин для эффективной амплификации ДНК, синтеза одноцепочечного потомства, сборки капсида и экспорта вириона, хотя, по-видимому, он не принимает прямого участия в этих процессах. NS2 первоначально накапливается до трех раз быстрее, чем NS1 в ранней S-фазе, но быстро перерабатывается посредством протеасом-опосредованного пути. По мере прогрессирования инфекционного цикла NS2 становится менее распространенным, поскольку транскрипция, управляемая P38, становится более заметной. ^[15] Другим примером является ядерный фосфопротеин NP1 бокавирусов, который, если не синтезируется, приводит к нежизнеспособным геномам потомства. ^[5]

По мере накопления вирусных NS-белков они управляют аппаратами репликации клетки-хозяина, прекращая синтез ДНК клетки-хозяина и вызывая начало амплификации вирусной ДНК. Вмешательство в репликацию ДНК хозяина может быть вызвано прямым воздействием на белки репликации хозяина, которые не являются существенными для репликации вируса, обширным разрывом ДНК хозяина или реструктуризацией ядра во время вирусной инфекции. На ранней стадии заражения парвовирусы создают в ядре очаги репликации, которые называются автономными телами репликации, ассоциированной с парвовирусом (APAR). NS1 локализуется совместно с реплицирующейся вирусной ДНК в этих структурах с другими клеточными белками, необходимыми для синтеза вирусной ДНК, ^[15]в то время как другие комплексы, не требующиеся для репликации, изолируются от тел APAR. Точный способ, которым белки включаются или исключаются из тельцов APAR, неясен и, по-видимому, варьируется от вида к виду и от типа клеток. ^[5] По мере прогрессирования инфекции микродомены APAR начинают сливаться с другими, ранее отличными друг от друга ядерными тельцами, образуя все более крупные ядерные включения, в которых происходит репликация вируса и сборка вирионов. После начала S-фазы клетка-хозяин вынуждена синтезировать вирусную ДНК и не может покинуть S-фазу. ^[17]

Правое начало MVM [ править ]

Правая шпилька MVM содержит 248 нуклеотидов ^[10], организованных в крестообразную форму. ^[1] Эта область почти идеально спарена по основанию, всего с тремя неспаренными основаниями на оси и несовпадающей областью, расположенной в 20 нуклеотидах от оси. Вставка из трех нуклеотидов, AGA или TCT, на одной цепи разделяет противоположные пары сайтов связывания NS1, создавая палиндром длиной 36 пар оснований, который может принимать альтернативную крестообразную конфигурацию. Ожидается, что такая конфигурация дестабилизирует дуплекс, что облегчит его работу в качестве шарнира. Несоответствие неспаренных оснований, а не самой трехнуклеотидной последовательности, может способствовать нестабильности дуплексной ДНК. ^[10]

Полностью дуплексные линейные формы правой последовательности шпильки также функционируют как NS1-зависимые начала. Однако для многих парвовирусных теломер только сайт связывания инициатора рядом с сайтом «ник» необходим для функции происхождения, так что минимальные последовательности, необходимые для «ник», составляют менее 40 пар оснований в длину. Для MVM минимальное начало правого конца составляет около 125 пар оснований в длину и включает большую часть последовательности шпильки, потому что задействованы по крайней мере три элемента распознавания: ник-сайт 5'-CTWWTCA-3 '(элемент 1), расположенный на семь нуклеотидов выше по течению. от дуплексного сайта связывания NS1 (элемент 2), который ориентирован так, чтобы присоединенный комплекс NS1 простирался по сайту ник, и второй сайт связывания NS1 (элемент 3), который находится рядом с осью шпильки. ^[10]

Второй сайт связывания находится на расстоянии более 100 пар оснований от сайта ник, но необходим для NS1-опосредованного расщепления. ^[10] In vivo , есть небольшие вариации в положении ника, плюс или минус один нуклеотид, при этом предпочтительным является одно положение. Во время никинга этот сайт, вероятно, экспонируется как одиночная цепь и потенциально стабилизируется как минимальная стебель-петля с помощью тетрануклеотидных инвертированных повторов по сторонам сайта. Оптимальные формы сайта связывания NS1 содержат по крайней мере три тандемные копии 5'-ACCA-3 'последовательности. Умеренные изменения этих мотивов оказывают лишь небольшое влияние на аффинность, что предполагает, что каждый тетрануклеотидный мотив распознается разными молекулами в комплексе NS1. Сайт связывания NS1, который позиционирует NS1 над сайтом ник в правом конце начала координат, является сайтом с высоким сродством.^[18]

С АТФ NS1 связывается асимметрично по вышеупомянутой последовательности, защищая область длиной 41 пару оснований от переваривания. Этот отпечаток простирается всего на пять нуклеотидов за 3'-конец повтора АССА, но на 22 нуклеотида за 5'-конец, так что отпечаток заканчивается на 15 нуклеотидов за пределами сайта nick, помещая NS1 в позицию, чтобы зарубить источник. Никинг происходит только в том случае, если второй, удаленный сайт связывания NS1 также присутствует в источнике, и весь комплекс активируется добавлением HMG1. ^[18]

В отсутствие NS1 HMG1 независимо связывает последовательность шпильки, заставляя ее изгибаться, не защищая какую-либо область от переваривания. HMG1 также может напрямую связываться с NS1 и опосредовать взаимодействия между молекулами NS1, связанными с их элементами распознавания в источнике, поэтому он важен для образования комплекса расщепления. Способность области оси преобразовываться в крестообразную, по-видимому, не имеет значения в этом процессе. Расщепление зависит от правильного расположения элементов источника, поэтому добавления и удаления могут быть летальными, тогда как замены допустимы. Добавление HMG1, по-видимому, лишь незначительно регулирует последовательности, защищенные NS1, но конформация промежуточной ДНК изменяется, складываясь в двойную спиральную петлю, которая простирается примерно на 30 пар оснований через гуанин.-богатый элемент в стержне шпильки. Между этим элементом и сайтом ник есть пять остатков тимидина, включенных в петлю, и сайт имеет область сбоку, содержащую много чередующихся остатков аденина и тимина , что, вероятно, увеличивает гибкость. Создание петли, вероятно, позволяет окончанию принять определенную трехмерную структуру, необходимую для активации никазы, поскольку источники, которые не могут реконфигурироваться в двойную спиральную петлю после добавления HMG1, не разрываются. ^[18]

Разрешение терминала [ править ]

После надреза на вновь обнаженном 3'-нуклеотиде устанавливается вилка репликации, которая продолжает разворачиваться и копировать шпильку на правом конце через серию реакций плавления и повторного отжига. ^{[9] [18]} Этот процесс начинается, когда NS1 надрезает внутренний конец оригинальной шпильки. Затем конечная последовательность копируется в противоположном направлении, что создает инвертированную копию исходной последовательности. ^[9] Конечным результатом является дуплексный конец расширенной формы, который содержит две копии терминальной последовательности. ^[18] Хотя для этого необходим NS1, неясно, опосредуется ли разворачивание его геликазной активностью перед вилкой или дестабилизацией дуплекса после связывания ДНК на одном из его 5 '- (ACCA) _n.-3 ′ сайты распознавания. ^[6] Этот процесс обычно называют конечным разрешением, но также и переносом шпильки или разрешением шпильки. ^{[6] [9]} Конечное разрешение происходит с каждым раундом репликации, поэтому геномы потомства содержат равное количество каждой концевой ориентации. Эти две ориентации называются «перевернуть» и «флоп» ^{[5] [6]} и могут быть представлены как R и r, или B и b, для переворота теломеры правого конца и L и l, или A и a, для переворота левого конца теломеры. ^{[7] [19]} Поскольку парвовирусные терминальные палиндромы несовершенны, легко определить, какая ориентация является какой. ^[1]

Дуплексные теломеры расширенной формы, образующиеся во время терминального разрешения, плавятся, опосредованно NS1 с гидролизом АТФ , заставляя отдельные нити загибаться на себя, создавая структуры шпильки «кроличье ухо», которые имеют перевернутые концы. Это требует активности геликазы NS1, а также ее сайт-специфической активности связывания, последняя из которых позволяет NS1 связываться с симметричными копиями сайтов связывания NS1, которые окружают ось конца расширенной формы. ^{[10] [20]}

Образование уха кролика позволяет 3'-нуклеотиду вновь синтезированной цепи ДНК спариваться с внутренним основанием, которое перемещает репликационную вилку в маневре переключения цепи, который запускает синтез дополнительных линейных последовательностей. ^[10] Переход от синтеза ДНК к образованию кроличьих ушей в конце терминального разрешения может потребовать различных типов комплексов NS1. Альтернативно, комплекс NS1 может оставаться неповрежденным во время этого переключения, будучи готовым начать синтез замещения стойки после рефолдинга в кроличьи уши. ^[20] После того, как репликационная вилка перемещена, репликация продолжается в направлении левого конца, используя вновь синтезированную цепь ДНК в качестве матрицы. ^[7]

В левом конце генома NS1, вероятно, необходим для раскрытия шпильки. NS1, по-видимому, принимает непосредственное участие в расплавлении и реконфигурации полученных дуплексов расширенной формы на левом конце в структуры уха кролика, хотя эта реакция, по-видимому, менее эффективна, чем на правом конце. Димерные и тетрамерные конкатемеры генома генерируются последовательно для MVM. В этих конкатемерах чередующиеся геномы единичной длины сливаются через палиндромное соединение в ориентациях левого конца к левому и правого конца к правому концу. ^{[1] [10]} В целом, RHR приводит к тому, что кодирующие последовательности генома копируются в два раза чаще, чем концы. ^{[1] [7] [10]}И линейная, и шпилечная конфигурации теломер правого конца поддерживают инициацию RHR, так что разрешение дуплексных соединений правого конца и правого конца может происходить симметрично на дуплексной последовательности с парными основаниями или после того, как этот комплекс плавится и реконфигурируется в две шпильки. Неясно, какая из этих двух реакций встречается чаще, поскольку обе, по-видимому, дают одинаковые результаты. ^[20]

У AAV каждая теломер имеет длину 125 оснований и может складываться в Т-образную шпильку. AAV содержит ген Rep, который кодирует четыре белка Rep, два из которых, Rep68 и Rep78, действуют как белки-инициаторы репликации и выполняют те же функции, например, активность никазы и геликазы, что и NS1. Они распознают и связываются с последовательностью (GAGC) ₃ в области стебля на конце и разрывают сайт на расстоянии 20 оснований, называемый trs.. Тот же процесс разрешения терминала, что и MVM, выполняется для AAV, но на обоих концах. Два других белка Rep, Rep52 и Rep40, не участвуют в репликации ДНК, но участвуют в синтезе потомства. Репликация AAV зависит от вспомогательного вируса, который является либо аденовирусом, либо вирусом герпеса, коинфектирующим клетку. В отсутствие коинфекции геном AAV интегрируется в ДНК клетки-хозяина до тех пор, пока не произойдет коинфекция. ^[1]

Общее правило состоит в том, что парвовирусы с идентичными концами, то есть гомотеломерные парвовирусы, такие как AAV и B19, реплицируют оба конца с помощью терминального разрешения, генерируя равное количество флипов и флопов каждой теломер. ^{[1] [4] [6]} Парвовирусы с разными концами, то есть гетеротеломерные парвовирусы, такие как MVM, реплицируют один конец за счет разрешения терминала, а другой конец за счет разрешения асимметричного соединения, что сохраняет ориентацию одной последовательности и требует различных структурных расположений и кофакторов. для активации никаза NS1. ^{[4] [10]}Промежуточные соединения ДНК AAV, содержащие ковалентно связанные смысловые и антисмысловые цепи, дают геномные конкатемеры в денатурирующих условиях, что указывает на то, что репликация AAV также синтезирует дуплексные конкатемеры, которые требуют некоторой формы разрешения соединений. ^[10]

Левый конец источника MVM [ править ]

В геномах MVM с отрицательным смыслом левая шпилька имеет длину 121 нуклеотид и существует в ориентации с одной обратной последовательностью. Эта теломера имеет Y-образную форму и содержит небольшие внутренние палиндромы, которые складываются в «уши» Y, дуплексную стеблевую область длиной 43 нуклеотида, которая прерывается асимметричным остатком тимидина, и несовпадающую «пузырьковую» последовательность, в которой 5 Последовательность '-GAA-3' на внутреннем плече противоположна 5'-GA-3 'на внешней ветви. ^{[1] [20]} Последовательности в этой шпильке участвуют как в репликации, так и в регуляции транскрипции. Элементы, участвующие в этих двух функциях, разделяют два плеча шпильки. ^[20]

Левый конец теломер MVM и, вероятно, всех гетеротеломерных парвовирусов не может функционировать в качестве ориджина репликации в своей шпилечной конфигурации. Вместо этого единственное начало на нижней цепи создается, когда шпилька разворачивается, удлиняется и копируется с образованием дуплексной последовательности с парными основаниями, которая охватывает соседние геномы в димере RF. В этой структуре последовательность от внешнего плеча, которая окружает динуклеотид GA / TC ^[1], служит источником OriL _TC . Эквивалентная последовательность GAA / TTC на внутреннем плече, содержащая пузырьковый тринуклеотид, называемый OriL _GAA., не служит источником. Вместо этого внутреннее плечо и конфигурация конца шпильки, по-видимому, функционируют как вышестоящие контрольные элементы для вирусного промотора транскрипции P4. Кроме того, для репликации важна способность отделить одну руку от надколов. ^[20]

Минимальное линейное начало левого конца составляет около 50 пар оснований в длину и простирается от двух мотивов 5'-ACGT-3 ', разнесенных на пять нуклеотидов на одном конце, до положения семь пар оснований за пределами сайта ник. Сама последовательность GA пузыря относительно не важна, но пространство, которое он занимает, необходимо для функционирования источника. ^{[1] [20]} Внутри ориджина есть три последовательности узнавания: сайт связывания NS1, который ориентирует комплекс NS1 над сайтом ник 5'-CTWWTCA-3 ', который расположен на 17 нуклеотидов ниже (по направлению к 3'- конец), и два мотива ACGT. Эти мотивы связывают гетеродимерный клеточный фактор, называемый либо парвовирусным фактором инициации (PIF), либо белок, модулирующий глюкокортикоидный элемент (GMEB). ^[21]

PIF представляет собой сайт-специфический ДНК-связывающий гетеродимерный комплекс, который содержит две субъединицы, p96 и p79, и функционирует как модулятор транскрипции в клетке-хозяине. Он связывает ДНК через складку KDWK и распознает два полусайта ACGT. Расстояние между этими сайтами может значительно варьироваться для PIF, от одного до девяти нуклеотидов, с оптимальным интервалом в шесть. PIF стабилизирует связывание NS1 с активной формой левого конца, OriL _TC , но не с неактивной формой, OriL _GAA , потому что два комплекса способны устанавливать контакт через бинуклеотид пузыря. Левая шпилька у всех других видов рода Protoparvovirus , ^{[примечание 6]}из которых принадлежит MVM, имеют асимметрию пузырьков и сайты связывания PIF, хотя и с небольшими вариациями в расстоянии. Это говорит о том, что все они имеют схожий механизм сегрегации по происхождению. ^[21]

Разрешение асимметричного перехода [ править ]

В связи с расположением активного происхождения OriL _TCв соединении димеров синтез новых копий шпильки левого конца в правильной, ieflip, ориентации непрост, поскольку репликационная вилка, перемещающаяся из этого сайта через линейную мостиковую структуру, должна синтезировать новую ДНК в ориентации flop. Вместо этого левое соединение димера MVM разрешается асимметрично в процессе, который создает крестообразный промежуточный продукт. Этот маневр выполняет две задачи: он позволяет синтезировать новую ДНК в правильной ориентации последовательности и создает структуру, которая может быть разрешена с помощью NS1. Эта «гетерокружная» модель синтеза предполагает, что разрешение управляется активностью геликазы NS1 и зависит от внутренней нестабильности дуплексного палиндрома, свойства, которое позволяет ему переключаться между его линейной и крестообразной конфигурациями. ^[21]

NS1 первоначально вводит одноцепочечный разрыв в OriL _TC в B («правом») плече соединения и становится ковалентно прикрепленным к ДНК на 5'-стороне разрыва, обнажая спаренный по основанию 3'-нуклеотид. Тогда могут произойти два результата, в зависимости от скорости сборки репликационной вилки. Если сборка происходит быстро, тогда, пока соединение находится в своей линейной конфигурации, "сквозной" синтез копирует верхнюю цепь, которая регенерирует дуплексное соединение и смещает положительно-смысловую цепь, которая возвращается в репликативный пул. Это способствует амплификации ДНК MVM, но не приводит к синтезу новых концевых последовательностей в правильной ориентации или к разрешению соединений. ^[22]

Чтобы создать разрешимую структуру, за первоначальным надрезом должно последовать плавление и перестройка димерного перехода в крестообразную форму. Это обусловлено 3'-5'-геликазной активностью 5'-связанного комплекса NS1. Как только эта крестообразная форма расширяется и включает последовательности за пределами сайта разрыва, экспонированный праймер в сайте разрыва в OriL _TC претерпевает переключение матрицы за счет отжига с его комплементом в нижнем плече крестообразной формы. Если после этой точки собирается вилка, то последующий синтез разворачивается и копирует нижнее крестообразное плечо. Это создает гетерокруциформный промежуточный продукт, который содержит вновь синтезированные теломеры в ориентации обратной последовательности, которые прикреплены к нижней цепи B-плеча. ^[22] Этот модифицированный переход называется MJ2. ^[23]

Нижняя часть MJ2 представляет собой дуплексный палиндром расширенной формы, который по существу идентичен палиндрому, генерируемому во время разрешения терминала. Как только MJ2 синтезируется, нижняя часть руки становится восприимчивой к образованию кроличьих ушей. Это репозиционирует 3'-нуклеотид вновь синтезированной копии нижнего плеча так, чтобы он спаривался с внутренними последовательностями на плече B соединения для первичного синтеза смещения цепи. Если репликационная вилка создается на этом 3'-нуклеотиде, то копируется нижняя цепь B-плеча, создавая промежуточное соединение, называемое MJ1, и постепенно смещая верхнюю цепь. Это приводит к высвобождению вновь синтезированной B-оборотной последовательности (B-ta). Остаточная крестообразная форма, называемая δJ,частично одноцепочечный в верхней части плеча B и содержит неповрежденную верхнюю нить соединения, соединенную с нижней нитью плеча A («левой»), с неповрежденной копией шпильки на левом конце, оканчивающейся на комплекс 5 ′ NS1. Поскольку δJ несет геликазу NS1, предполагается, что она периодически меняет конфигурацию.^{[22] [23]}

Следующий шаг менее определен, но его можно сделать на основании того, что на данный момент известно о процессе. Ожидается, что геликаза NS1 создаст динамическую структуру, в которой сайт разрыва в δJ на обычно неактивной стороне A временно, но многократно экспонируется в одноцепочечной форме во время перестройки дуплекса в шпильку, что позволяет NS1 взаимодействовать с сайтом разрыва. в оригинале OriL _GAA без помощи кофактора. Ника оставит NS1 ковалентно присоединенным к положительно-смысловой "B" цепи δJ и приведет к высвобождению этой цепи. Nicking также оставляет открытым 3'-нуклеотид, спаренный по основанию, на «A» цепи δJ для первичного синтеза ДНК. Если здесь устанавливается репликационная вилка, то нить A разворачивается и копируется для создания ее дуплексной расширенной формы. ^[23]

Когда геномы MVM реплицируются in vivo, вышеупомянутый разрыв может не возникать, потому что оба конца репликативной формы димера содержат эффективное количество точек начала шпильки на правом конце. Следовательно, вилки репликации могут продвигаться назад к димерному соединению от правого конца генома, копируя верхнюю цепь B-плеча перед окончательной разрешающей способностью. Это обходит разделение димерного мостика и рециркулирует верхнюю цепь в реплицирующийся дуплексный пул димеров. В близкородственном вирусе, LuIII, однонитевой разрыв высвобождает позитивно-смысловую цепь с его шпилькой на левом конце в ориентации флопа. В отличие от MVM, LuIII упаковывает нити обоих смыслов с одинаковой частотой. В прядях с отрицательным смыслом все шпильки на левом конце имеют перевернутую ориентацию, в то время как в прядях с положительным смыслом имеется равное количество ориентаций перевертывания и опрокидывания. По сравнению с MVM,LuIII содержит вставку из двух оснований непосредственно на 3'-направлении ник-сайта в правом источнике, что снижает его эффективность. Из-за этого сниженная эффективность сборки репликационной вилки на правом конце генома может способствовать возникновению однонитевого надреза, давая ему больше времени для возникновения.^[23]

Синтез потомства [ править ]

Индивидуальные геномы потомства вырезают из геномных репликативных конкатемеров, начиная с введения разрывов в ориджинах репликации, обычно с помощью белка инициатора репликации. Это приводит к созданию новых репликационных вилок, которые реплицируют теломеры в комбинации терминального разрешения и разрешения соединений и вытесняют отдельные геномы оцДНК из репликативной молекулы. ^{[7] [20]} В конце этого процесса теломеры загибаются внутрь, образуя шпильки на вырезанных геномах. Концы расширенной формы, созданные во время вырезания, напоминают молекулы расширенной формы до конечного разрешения, поэтому их можно расплавить и снова свернуть в кроличьи уши для дополнительных раундов репликации. ^[1]Следовательно, внутри инфицированной клетки могут возникать многочисленные репликативные конкатемеры. ^[7]

Смещение геномов оцДНК потомства происходит либо: преимущественно или исключительно во время активной репликации ДНК, либо когда клетки собирают вирусные частицы. Таким образом, смещение одиночных цепей может быть связано с упаковкой вирусной ДНК в капсиды. Более ранние исследования показали, что предварительно собранная вирусная частица может секвестрировать геном в направлении 5'-к-3 ', когда он смещается от вилки, но более поздние исследования показывают, что упаковка осуществляется в направлении 3'-к-5'. с помощью геликазы NS1 с использованием вновь синтезированных одиночных цепей. ^[24]

Неясно, высвобождаются ли эти одиночные цепи в нуклеоплазму, так что комплексы упаковки физически отделены от комплексов репликации, или промежуточные продукты репликации служат как субстратами как репликации, так и упаковки. В последнем случае вновь перемещенные геномы потомства будут сохраняться в репликационном комплексе за счет взаимодействий между их 5'-связанными молекулами NS1 и NS1 или белками капсида, которые физически связаны с реплицирующейся ДНК. ^[24] Геномы вставляются в капсид через вход, называемый порталом, расположенный на одной из икосаэдрических 5-кратных осей капсида, ^[4] который, возможно, находится напротив отверстия, из которого геномы удаляются в начале цикла репликации. ^[5]

Выбор цепи для инкапсидации, вероятно, не связан с конкретными сигналами упаковки, но может быть предсказан математической моделью кинетического переноса шпильки (KHT), которая объясняет распределение цепей и концевые конформации упакованных геномов с точки зрения эффективности, с которой каждый тип конца может претерпевают реакции, которые позволяют его копировать и преобразовывать. Другими словами, модель KHT постулирует, что относительная эффективность, с которой два геномных конца разрешаются и реплицируются, определяет распределение амплифицированных промежуточных продуктов репликации, созданных во время инфекции, и, в конечном итоге, эффективность, с которой вырезаются оцДНК с характерной полярностью и концевой ориентацией, которые затем будут быть упакованы с одинаковой эффективностью. ^{[4] [24]}

Предпочтительное удаление определенных геномов очевидно только во время упаковки. Следовательно, среди парвовирусов, которые упаковывают цепи одного смысла, репликация оказывается двухфазной. Вначале иссекают обе смысловые нити. За этим следует переключение в режим репликации, который позволяет осуществлять эксклюзивный синтез единого смысла для упаковки. Модифицированная форма модели KHT, называемая моделью предпочтительного смещения цепи, предполагает, что вышеупомянутое переключение в репликации вызвано началом упаковки, потому что субстрат для упаковки, вероятно, является недавно вытесненной молекулой ДНК. ^[24]Для гетеротеломерных парвовирусов дисбаланс инициирования происхождения приводит к предпочтительному смещению отрицательных смысловых цепей с правого конца источника. Таким образом, относительная частота смысловых цепей в упакованных вирионах может использоваться для определения типа механизма разрешения, используемого во время вырезания. ^[5]

Вскоре после начала S-фазы трансляция вирусной мРНК приводит к накоплению капсидных белков в ядре. Эти белки образуют олигомеры, которые собираются в целые пустые капсиды. После инкапсидации полные вирионы могут быть экспортированы из ядра во внешнюю среду клетки до дезинтеграции ядра. Нарушение среды клетки-хозяина может также произойти позже при инфицировании. Это приводит к лизису клеток посредством некроза или апоптоза , при котором вирионы высвобождаются за пределы клетки. ^{[4] [17]}

Сравнение с репликацией катящегося круга [ править ]

Многие небольшие репликоны, имеющие кольцевые геномы, такие как кольцевые вирусы оцДНК и кольцевые плазмиды, реплицируются посредством репликации по катящемуся кругу (RCR), которая представляет собой однонаправленную форму репликации ДНК со смещением цепей, аналогичную RHR. В RCR последовательные раунды репликации, которые происходят в петле вокруг генома, инициируются и завершаются сайт-специфическими одноцепочечными разрывами, создаваемыми эндонуклеазой, кодируемой репликонами, которую по-разному называют никазой, релаксазой, мобилизационным белком (mob), трансэстераза или репликационный белок (Rep). Белок инициатора репликации парвовирусов генетически связан с этими другими эндонуклеазами. ^[17]

Белки-инициаторы RCR содержат три мотива, которые считаются важными для репликации. Два из них сохраняются в белках-инициаторах парвовирусов: кластер HUHUUU, который, как предполагается, связывается с Mg²⁺
ион, необходимый для разрыва, и мотив YxxxK, который содержит остаток тирозина в активном центре, который атакует фосфодиэфирную связь целевой ДНК. В отличие от белков-инициаторов RCR, которые могут соединять цепи ДНК, белки-инициаторы RHR имеют лишь рудиментарные следы способности выполнять лигирование. ^[17]

RCR начинается, когда белок-инициатор разрывает цепь ДНК в определенной последовательности в области ориджина репликации. Это осуществляется посредством реакции переэтерификации, которая формирует 5'-фосфатную связь, которая соединяет ДНК с тирозином активного центра и освобождает 3'-концевой гидроксил (3'-OH), прилегающий к сайту ник. Затем 3'-конец используется в качестве праймера для ДНК-полимеразы хозяина, чтобы начать репликацию, в то время как белок-инициатор остается прикрепленным к 5'-концу «исходной» цепи. После одной петли репликации вокруг кольцевого генома белок-инициатор возвращается в ник-сайт, то есть в исходный комплекс инициатора, все еще прикрепленный к родительской цепи, и атакует регенерированный ник-сайт дуплекса или в некоторых случаях соседний второй сайт посредством средство топоизомеразоподобной реакции присоединения к нему.^[17]

Во время вышеупомянутой реакции белок-инициатор расщепляет новый сайт разрыва и переносится через аналогичную фосфодиэфирную связь. Таким образом, он присоединяется к новому 5'-концу при лигировании 5'-конца первой цепи, к которой он был первоначально прикреплен, к 3'-концу той же цепи. Этот второй механизм варьируется в зависимости от репликона. Некоторые репликоны, такие как вирус ΦX174, содержат второй активный остаток тирозина в белке-инициаторе. Другие используют аналогичный тирозин активного центра во втором белке-инициаторе, который присутствует как часть мультимерного комплекса никазы. ^[17]

Эта вторая реакция «раскалывания» может происходить после одной петли или могут возникать последовательные петли, в которых создается конкатемер, содержащий несколько копий генома. Результатом этого разрыва является то, что смещенные геномы отделяются от репликативной молекулы. Эти копии генома лигированы и могут быть инкапсидированы в капсиды потомства, при условии, что они являются мономерными, или преобразованы в ковалентно-замкнутую двухцепочечную форму ДНК-полимеразой хозяина для дальнейшей репликации. В то время как RHR обычно включает репликацию обеих смысловых цепей в непрерывном процессе, RCR имеет синтез комплементарной цепи, а синтез геномной цепи происходит отдельно. ^[7]

Стратегии, используемые в RHR для взаимодействия с ником, также присутствуют в RCR. Большинство источников RCR имеют форму дуплексной ДНК, которую необходимо расплавить перед тем, как разрезать. Инициаторы RCR достигают этого путем связывания со специфическими ДНК-связывающими последовательностями в источнике рядом с сайтом инициации. ^[17] Последний сайт затем плавится в процессе, который потребляет АТФ, чему способствует способность разделенных цепей переконфигурироваться в структуры «стебель-петля». В этих структурах ник-сайт представлен на открытой петле. Подобно белкам-инициаторам RHR, многие белки-инициаторы RCR обладают геликазной активностью, которая позволяет им плавить ДНК перед разрывом и служить в качестве геликазы 3'-к-5 'в репликационной вилке. ^[19]

Заметки [ править ]

Ссылки [ править ]

Библиография [ править ]

• Керр Дж., Котмор С., Блум М.Э. (25 ноября 2005 г.). Парвовирусы . CRC Press. С. 171–185. ISBN 9781444114782.