Из Википедии, свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Тетрамерный анализ
СинонимыТетрамерное пятно
Цельиспользует тетрамерные белки для обнаружения и количественной оценки Т-клеток

Анализ тетрамер (также известный как тетрамер пятно ) это процедура , которая использует тетрамерные белки для обнаружения и количественной оценки Т - клетки , которые являются специфическими для данного антигена в образце крови. [1] Тетрамеры, используемые в анализе, состоят из четырех молекул главного комплекса гистосовместимости (MHC), которые находятся на поверхности большинства клеток организма. [2] Молекулы MHC представляют собой пептиды.с Т-клетками как способ сообщить о наличии вирусов, бактерий, раковых мутаций или других антигенов в клетке. Если рецептор Т-клетки совпадает с пептидом, представленным молекулой MHC, запускается иммунный ответ. [3] Таким образом, тетрамеры MHC, которые биоинженерии представляют определенный пептид, могут быть использованы для поиска Т-клеток с рецепторами, соответствующими этому пептиду.

Тетрамеры помечаются флуорофором , что позволяет анализировать связанные с тетрамером Т-клетки с помощью проточной цитометрии . [4] Количественная оценка и сортировка Т-клеток с помощью проточной цитометрии позволяет исследователям исследовать иммунный ответ на вирусную инфекцию и введение вакцины, а также функциональность антиген-специфических Т-клеток. [5] Как правило, если иммунная система человека столкнулась с патогеном , он будет обладать Т-клетками со специфичностью в отношении какого-либо пептида этого патогена. Следовательно, если окрашивание тетрамера, специфичное для патогенного пептида, дает положительный сигнал, это может указывать на то, что иммунная система человека столкнулась с этим патогеном и создала ответ на него.[ необходима цитата ]

История [ править ]

Эта методология была впервые опубликована в 1996 году лабораторией Стэнфордского университета. [6] Предыдущие попытки количественно определить антиген-специфические Т-клетки включали менее точный анализ с ограничением разведения, который оценивал количество Т-клеток в 50-500 раз ниже их фактических уровней. [7] [8] Окрашивание с использованием растворимых мономеров MHC также оказалось безуспешным из-за низкого сродства связывания рецепторов Т-клеток и мономеров пептидов MHC. Тетрамеры MHC могут связываться более чем с одним рецептором Т-клетки-мишени, что приводит к увеличению общей силы связывания и снижению скорости диссоциации. [5]

Использует [ редактировать ]

CD8 + Т-клетки [ править ]

Окрашивание тетрамерами обычно анализирует популяции цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL). [9] CTL также называют CD8 + Т-клетками, потому что они имеют корецепторы CD8, которые связываются с молекулами MHC класса I. Большинство клеток в организме экспрессируют молекулы MHC класса I, которые отвечают за обработку внутриклеточных антигенов и присутствие на поверхности клетки. Если пептиды, представленные молекулами MHC класса I, являются чужеродными - например, получены из вирусных белков, а не из собственных белков клетки, - CTL с рецептором, который соответствует пептиду, разрушат клетку. [2] [3] Окрашивание тетрамерами позволяет визуализировать, количественно определять и сортировать эти клетки с помощью проточной цитометрии, что чрезвычайно полезно в иммунологии.. Популяции Т-лимфоцитов можно отслеживать на протяжении вируса или после применения вакцины. Окрашивание тетрамеров также можно сочетать с функциональными анализами, такими как ELIspot, который определяет количество клеток, секретирующих цитокины, в образце. [9]

Конструкция тетрамера MHC класса I [ править ]

Тетрамер MHC содержит четыре комплекса MHC / пептид, которые могут связываться с рецепторами на антигенспецифической Т-клетке. К тетрамеру присоединена флуоресцентная молекула для анализа Т-клеток. Молекулы MHC экспрессируются большинством клеток организма и представляют собой пептиды, которые Т-клетки могут распознавать и на которые реагируют.
Тетрамер MHC, связывающийся с рецепторами T-клеток (слева), и молекула MHC на поверхности антиген-представляющей клетки, связывающаяся с рецепторами T-клеток (справа)

Молекулы тетрамера MHC, разработанные в лаборатории, могут имитировать антигенпрезентирующий комплекс на клетках и связываться с Т-клетками, которые распознают антиген. Молекулы MHC класса I состоят из полиморфной тяжелой α-цепи, связанной с инвариантным бета-2-микроглобулином легкой цепи (β2m). Escherichia coli используются для синтеза легкой цепи и укороченной версии тяжелой цепи, которая включает биотин.Тег распознавания 15 аминокислот. Эти цепи MHC биотинилируются ферментом BirA и подвергаются повторной укладке с использованием интересующего антигенного пептида. Биотин - это небольшая молекула, которая образует прочную связь с другим белком, называемым стрептавидином. Меченый флуорофором стрептавидин добавляется к биоинженерным мономерам MHC, и взаимодействие биотин-стрептавидин заставляет четыре мономера MHC связываться со стрептавидином и создавать тетрамер. Когда тетрамеры смешиваются с образцом крови, они связываются с Т-клетками, экспрессирующими соответствующий антигенспецифический рецептор. Все несвязанные тетрамеры MHC вымываются из образца перед его анализом с помощью проточной цитометрии. [9]

Последние достижения в области рекомбинантных молекул MHC позволили демократизировать состав пептидного комплекса MHC и последующую мультимеризацию. Высокоактивные составы широкого диапазона молекул MHC класса I [10] теперь позволяют пользователям, не являющимся экспертами, изо дня в день создавать собственные индивидуальные комплексы пептид-MHC в любой лаборатории без специального оборудования. [ необходима цитата ]

CD4 + Т-клетки [ править ]

Также были разработаны тетрамеры, которые связываются с Т-хелперами. [9] Хелперные Т-клетки или CD4 + Т-клетки экспрессируют корецепторы CD4 . Они связываются с молекулами MHC класса II , которые экспрессируются только в профессиональных антигенпредставляющих клетках, таких как дендритные клетки или макрофаги . Молекулы MHC класса II представляют внеклеточные антигены, позволяя Т-клеткам-помощникам обнаруживать бактерии, грибки и паразитов. [2] Тетрамер MHC класса II становится все более распространенным, но тетрамеры труднее создать, чем тетрамеры класса I, а связь между хелперными Т-клетками и молекулами MHC еще слабее. [9] [11]

Природные Т-клетки-убийцы [ править ]

Естественные Т-клетки-киллеры (NKT-клетки) также можно визуализировать с помощью тетрамерной технологии. NKT-клетки связываются с белками, которые представляют липидные или гликолипидные антигены. [12] Антигенпредставляющий комплекс, с которым связываются NKT-клетки, включает белки CD1 , поэтому тетрамеры, состоящие из CD1, можно использовать для окрашивания NKT-клеток. [9]

Примеры [ править ]

Раннее применение технологии тетрамеров было сосредоточено на клеточно-опосредованном иммунном ответе на ВИЧ- инфекцию. Тетрамеры MHC были разработаны для представления антигенов ВИЧ и использованы для определения процента CTL, специфичных для этих антигенов ВИЧ, в образцах крови инфицированных пациентов. Это сравнивали с результатами цитотоксических анализов и вирусной нагрузки РНК плазмы, чтобы охарактеризовать функцию CTL при ВИЧ-инфекции. CTL, которые связывались с тетрамерами, сортировали в лунки ELIspot для анализа секреции цитокинов. [13]

В другом исследовании использовались тетрамерные комплексы MHC для изучения эффективности метода доставки вакцины против гриппа . Мышам делали подкожную и интраназальную вакцинацию от гриппа, и красители тетрамера в сочетании с проточной цитометрией использовали для количественного определения CTL, специфичных к антигену, используемому в вакцине. Это позволило сравнить иммунный ответ (количество Т-клеток, нацеленных на вирус) при двух различных методах доставки вакцины. [14]

Ссылки [ править ]

  1. ^ "Руководство по окрашиванию тетрамеров" . Mblintl.com . 2019.
  2. ^ a b c «Главный комплекс гистосовместимости» . ИнтерПро . Европейский институт биоинформатики (EMBL-EBI) . Проверено 2 декабря 2018 .
  3. ^ а б «Адаптивный иммунный ответ: Т-лимфоциты и их функциональные типы» . Анатомия и физиология II . Lumen Learning . Проверено 2 декабря 2018 .
  4. ^ "MHC Tetramers" . ООО "Медико-биологические лаборатории" (МБЛ) . Проверено 2 декабря 2018 .
  5. ^ a b «Технология MHC Tetramer - Примечание 7.2» . Thermo Fisher Scientific . Проверено 2 декабря 2018 .
  6. ^ Altman JD, Moss PA, Goulder PJ, Barouch DH, McHeyzer-Williams MG, Bell JI, МакМайкл AJ, Davis MM (июль 2011). «Фенотипический анализ антиген-специфических Т-лимфоцитов. Science. 1996. 274: 94-96». Журнал иммунологии . 187 (1): 7–9. JSTOR 2891862 . PMID 21690331 .  
  7. ^ Kimball JW. «Анализ предельного разбавления» . Страницы биологии Кимбалла . Фонд Сэйлора . Проверено 2 декабря 2018 .
  8. ^ МакМайкл AJ, О'Каллаган CA (май 1998). «Новый взгляд на Т-клетки» . Журнал экспериментальной медицины . 187 (9): 1367–71. DOI : 10,1084 / jem.187.9.1367 . PMC 2212275 . PMID 9565629 .  
  9. ^ a b c d e f Sims S, Willberg C, Klenerman P (июль 2010 г.). «Тетрамеры MHC-пептидов для анализа антигенспецифических Т-клеток». Экспертный обзор вакцин . 9 (7): 765–74. DOI : 10,1586 / erv.10.66 . PMID 20624049 . S2CID 20822684 .  
  10. ^ "Сделай сам - Тетрамеры MHC I класса" . ImmunAware.com . 2019.
  11. ^ Джеймс EA, LaFond R, Durinovic-Белло I, Квок W (март 2009). «Визуализация антиген-специфических CD4 + Т-клеток с использованием тетрамеров MHC класса II» . Журнал визуализированных экспериментов (25). DOI : 10.3791 / 1167 . PMC 2789100 . PMID 19270641 .  
  12. ^ Шекхар S, JOYEE AG, Ян X (2014). «Инвариантные естественные Т-клетки-киллеры: благо или пагуба для иммунитета к внутриклеточным бактериальным инфекциям?» . Журнал врожденного иммунитета . 6 (5): 575–84. DOI : 10.1159 / 000361048 . PMC 6741619 . PMID 24903638 .  
  13. ^ Ogg GS, Jin X, Bonhoeffer S, Dunbar PR, Nowak MA, Monard S, Segal JP, Cao Y, Rowland-Jones SL, Cerundolo V, Hurley A, Markowitz M, Ho DD, Nixon DF, McMichael AJ (март 1998 г.) ). «Количественное определение ВИЧ-1-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов и плазменной нагрузки вирусной РНК» . Наука . 279 (5359): 2103–6. Bibcode : 1998Sci ... 279.2103O . DOI : 10.1126 / science.279.5359.2103 . PMID 9516110 . 
  14. ↑ Si Y, Wen Y, Kelly SH, Chong AS, Collier JH (июль 2018 г.). «+ Т-клеточные ответы» . Журнал контролируемого выпуска . 282 : 120–130. DOI : 10.1016 / j.jconrel.2018.04.031 . PMC 6309200 . PMID 29673645 .  

Дальнейшее чтение [ править ]

  • Альтман Дж.Д., Мосс П.А., Гоулдер П.Дж., Баруш Д.Х., МакХейзер-Уильямс М.Г., Белл Дж. «Фенотипический анализ антигенспецифических Т-лимфоцитов». Наука . 274 (5284): 94–6. Bibcode : 1996Sci ... 274 ... 94A . DOI : 10.1126 / science.274.5284.94 . PMID  8810254 . S2CID  12667633 .