Кассетный мутагенез — это тип сайт-направленного мутагенеза , при котором используется короткая двухцепочечная олигонуклеотидная последовательность ( генная кассета ) для замены фрагмента целевой ДНК . Для достижения специфичности он использует комплементарные расщепляемые ферментом рестрикции концы целевой ДНК и генной кассеты . Он отличается от методов, в которых используется одиночный олигонуклеотид, тем, что одна кассета гена может содержать несколько мутаций. В отличие от многих методов сайт-направленного мутагенеза, кассетный мутагенез также не включает удлинение праймера с помощью ДНК-полимеразы . [1] [2] [3] [4] [5]
Во-первых, ферменты рестрикции используются для расщепления ДНК вблизи целевой последовательности, содержащейся в подходящем векторе . На этом этапе удаляется целевая последовательность и все, что находится между сайтами рестрикции. Затем синтетическую двухцепочечную ДНК, содержащую желаемую мутацию и концы , комплементарные концам рестрикционного расщепления, лигируют вместо удаленной последовательности. Наконец, полученную конструкцию секвенируют , чтобы проверить, содержит ли целевая последовательность намеченную мутацию. [1]
Использование синтетической генной кассеты позволяет полностью контролировать тип мутации, которая может возникнуть. При изучении функций белков кассетный мутагенез может позволить ученым изменять отдельные аминокислоты , вводя разные кодоны или опуская кодоны. [1] [2]
Включив последовательность SD и несколько первых кодонов гена, ученый может легко и существенно повлиять на уровень экспрессии белка, изменяя эти регуляторные последовательности . [2]
Чтобы использовать этот метод, необходимо знать последовательность целевой последовательности и близлежащие сайты рестрикции. Поскольку используются ферменты рестрикции , чтобы этот метод был полезен, сайты рестрикции, фланкирующие целевую ДНК, должны быть уникальными в системе ген / вектор , чтобы генную кассету можно было вставить со специфичностью. Длина последовательности, фланкированной сайтами рестрикции, также является ограничивающим фактором из-за использования синтетических генных кассет. [2] [3]
Поскольку одна генная кассета может содержать несколько мутаций, требуется меньше общего синтеза и очистки олигонуклеотидов. По сравнению с методами мутагенеза, требующими синтеза двухцепочечной ДНК с использованием одноцепочечной матрицы (1-30% in vitro в М13 ), эффективность лигирования олигодезоксинуклеотидной кассеты близка к 100%. Высокая эффективность мутагенеза означает, что мутанты могут быть проверены непосредственно путем секвенирования. [2] После того, как вектор снабжен фланкирующими сайтами рестрикции, все манипуляции (т.е. мутагенез , секвенирование , экспрессия ) можно выполнять в одной и той же плазмиде . [2]