Диэтилпирокарбонат
Диэтилпирокарбонат ( DEPC ), также называемый диэтилдикарбонатом ( название IUPAC ), используется в лаборатории для инактивации ферментов РНКазы в воде и на лабораторной посуде. Это достигается за счет ковалентной модификации остатков гистидина (наиболее сильно), лизина , цистеина и тирозина . [1] [2]
Обработанная DEPC (и, следовательно, свободная от РНКазы) вода используется при работе с РНК в лаборатории, чтобы снизить риск деградации РНК РНКазами.
Воду обычно обрабатывают 0,1% по объему ДЭПК в течение не менее 2 часов при 37 °C, а затем автоклавируют (не менее 15 минут) для инактивации следов ДЭПК. Инактивация DEPC таким образом дает CO 2 и этанол . Более высокие концентрации DEPC способны дезактивировать большее количество РНКазы, но оставшиеся следы или побочные продукты могут ингибировать дальнейшие биохимические реакции, такие как транскрипция in vitro. Кроме того, химическая модификация РНК, такая как карбоксиметилирование, возможна, когда присутствуют следы DEPC или его побочных продуктов, что приводит к нарушению восстановления интактной РНК даже после замены буфера (после преципитации).
ДЭПК нестабилен в воде и подвержен гидролизу до диоксида углерода и этанола, особенно в присутствии нуклеофила . По этой причине DEPC нельзя использовать с буферами Tris или HEPES . Напротив, его можно использовать с фосфатно-солевым буфером или MOPS . [3] Удобным правилом является то, что ферменты или химические вещества, которые имеют активные -O:, -N: или -S:, не могут быть обработаны DEPC, чтобы стать свободными от РНКазы, так как DEPC реагирует с этими видами. Кроме того, продукты деградации DEPC могут ингибировать транскрипцию in vitro.
Дериватизация гистидинов DEPC также используется для изучения важности гистидильных остатков в ферментах . Модификация гистидина с помощью DEPC приводит к карбэтоксилированным производным по атому азота N-омега-2 имидазольного кольца. Модификацию гистидинов DEPC можно обратить обработкой 0,5 М гидроксиламином при нейтральном pH.
