Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Высокое содержанием скрининг (HCS), также известный как высокое содержания анализ (ГКА) или Cellomics , представляет собой метод , который используется в биологических исследованиях и новой лекарственных средств для идентификации веществ , таких как малые молекулы , пептиды , или RNAi , которые изменяют фенотип из клетки желаемым образом. [1] [2] Следовательно, скрининг с высоким содержанием - это тип фенотипического скрининга, проводимого в клетках, включающий анализ целых клеток или компонентов клеток с одновременным считыванием нескольких параметров. [3] HCS относится к высокопроизводительному скринингу.(HTS), в котором тысячи соединений тестируются параллельно на их активность в одном или нескольких биологических анализах, но включает в себя анализы более сложных клеточных фенотипов в качестве выходных данных. [4] Фенотипические изменения могут включать увеличение или уменьшение продукции клеточных продуктов, таких как белки, и / или изменения морфологии (внешнего вида) клетки. Следовательно, HCA обычно включает автоматизированную микроскопию и анализ изображений. [4] В отличие от анализа высокого контента, скрининг высокого контента подразумевает уровень пропускной способности, поэтому термин «скрининг» отличает HCS от HCA, который может быть высоким по содержанию, но с низкой пропускной способностью.

При скрининге с высоким содержанием клетки сначала инкубируются с веществом, а через некоторое время анализируются структуры и молекулярные компоненты клеток. Наиболее распространенный анализ включает маркировку белков флуоресцентными метками , и, наконец, изменения фенотипа клеток измеряются с помощью автоматического анализа изображений . Используя флуоресцентные метки с разными максимумами поглощения и излучения, можно параллельно измерять несколько различных компонентов ячейки. Кроме того, визуализация способна обнаруживать изменения на субклеточном уровне (например, цитоплазма по сравнению с ядром по сравнению с другими органеллами).). Следовательно, для каждой ячейки может быть собрано большое количество точек данных. Помимо флуоресцентного мечения, для скрининга высокого содержания использовались различные анализы без метки. [5]

Общие принципы [ править ]

Одно из приложений HCS - открытие новых кандидатов в лекарства.

Скрининг с высоким содержанием (HCS) в клеточных системах использует живые клетки в качестве инструментов в биологических исследованиях для выяснения работы нормальных и больных клеток. HCS также используется для обнаружения и оптимизации новых кандидатов в лекарственные препараты. Скрининг высокого содержания представляет собой сочетание современной клеточной биологии со всеми ее молекулярными инструментами, автоматизированной микроскопии высокого разрешения и роботизированной обработки. Клетки сначала подвергаются воздействию химикатов или реагентов РНКи . Затем с помощью анализа изображений обнаруживаются изменения в морфологии клеток . Изменения количества белков, синтезируемых клетками, измеряются с использованием различных методов, таких как зеленые флуоресцентные белки, слитые с эндогенными белками, илифлуоресцентные антитела .

Технология может использоваться для определения того, модифицирует ли потенциальное лекарство болезнь. Например, у людей рецепторы, сопряженные с G-белками (GPCR), представляют собой большое семейство из около 880 белков клеточной поверхности, которые преобразуют внеклеточные изменения окружающей среды в клеточный ответ, например, запускают повышение артериального давления из-за высвобождения регулирующий гормон в кровоток. Активация этих GPCR может включать их проникновение в клетки, и когда это можно визуализировать, это может быть основой систематического анализа функции рецепторов с помощью химической генетики , систематического скрининга на уровне всего генома или физиологических манипуляций.

На клеточном уровне параллельный сбор данных о различных свойствах клеток, например активности каскадов передачи сигналов и целостности цитоскелета, является основным преимуществом этого метода по сравнению с более быстрым, но менее подробным высокопроизводительным скринингом . Хотя HCS работает медленнее, множество полученных данных позволяет более глубоко понять эффекты лекарств.

Автоматизированный скрининг на основе изображений позволяет идентифицировать небольшие соединения, изменяющие клеточные фенотипы, и представляет интерес для открытия новых фармацевтических препаратов и новых биологических инструментов клетки для изменения функции клеток. Выбор молекул на основе клеточного фенотипа не требует предварительного знания биохимических мишеней, на которые действуют соединения. Однако идентификация биологической мишени значительно упростит последующую доклиническую оптимизацию и клиническую разработку соединения. Учитывая рост использования фенотипического / визуального скрининга в качестве биологического инструмента клетки, необходимы методы, позволяющие систематически идентифицировать биохимические мишени, если эти молекулы будут широко использоваться. [6]Идентификация цели была определена как этап, ограничивающий скорость в химической генетике / скрининге с высоким содержанием. [7]

Инструменты [ править ]

Автоматический считыватель конфокальных изображений

Технология высокопроизводительного скрининга в основном основана на автоматизированной цифровой микроскопии и проточной цитометрии в сочетании с ИТ-системами для анализа и хранения данных. Технологии «высококонтентной» или визуальной биологии преследуют две цели: во-первых, получить информацию о событии с пространственным или временным разрешением, а во-вторых, автоматически дать количественную оценку. Приборы с пространственным разрешением - это, как правило, автоматизированные микроскопы , и временное разрешение в большинстве случаев все еще требует некоторой формы измерения флуоресценции. Это означает, что многие инструменты HCS ( флуоресценция) микроскопы, которые подключены к некоторой форме пакета анализа изображений. Они позаботятся обо всех этапах получения флуоресцентных изображений клеток и обеспечат быструю, автоматизированную и беспристрастную оценку экспериментов.

Инструменты HCS, представленные сегодня на рынке, можно разделить на основе множества спецификаций, которые существенно влияют на универсальность инструментов и общую стоимость. К ним относятся скорость, камера с живыми клетками, которая включает в себя контроль температуры и CO2 (некоторые также имеют контроль влажности для более долгосрочной визуализации живых клеток), встроенный пипеточный дозатор или инжектор для быстрых кинетических анализов и дополнительные режимы визуализации, такие как конфокальная, яркое поле, фазовый контраст и FRET. Одно из самых существенных различий заключается в том, являются ли инструменты оптическими конфокальными или нет. Конфокальная микроскопиярезюмируется как отображение / разрешение тонкого среза через объект и отклонение не в фокусе света, исходящего извне этого среза. Конфокальная визуализация обеспечивает более высокое соотношение сигнал / шум и более высокое разрешение, чем более широко применяемая эпифлуоресцентная микроскопия . В зависимости от инструмента конфокальность достигается с помощью лазерного сканирования, одного вращающегося диска с отверстиями или прорезями, двойного вращающегося диска или виртуальной щели. Между этими различными конфокальными методами существует компромисс между чувствительностью, разрешением, скоростью, фототоксичностью, фотообесцвечиванием, сложностью инструмента и ценой.

Общим для всех инструментов является способность автоматически снимать, хранить и интерпретировать изображения, а также интегрировать их в большие роботизированные платформы для обработки ячеек и сред.

Программное обеспечение [ править ]

Многие экраны анализируются с помощью программного обеспечения для анализа изображений, которое прилагается к прибору, обеспечивая готовое решение. Альтернативы стороннему программному обеспечению часто используются для особо сложных экранов или в тех случаях, когда лаборатория или учреждение имеет несколько приборов и желает стандартизировать их до единой аналитической платформы. Некоторое программное обеспечение прибора обеспечивает массовый импорт и экспорт изображений и данных для пользователей, которые хотят выполнить такую ​​стандартизацию на единой платформе анализа без использования стороннего программного обеспечения.

Приложения [ править ]

Эта технология позволяет проводить (очень) большое количество экспериментов, позволяя проводить исследовательский скрининг. Клеточные системы в основном используются в химической генетике, где систематически проверяются большие и разнообразные коллекции небольших молекул на предмет их влияния на клеточные модельные системы. Новые лекарства можно найти с помощью экранов из десятков тысяч молекул, и это дает надежду на будущее разработки лекарств. Помимо открытия лекарств, химическая генетика направлена ​​на функционализацию генома путем выявления небольших молекул, которые действуют на большую часть из 21 000 генных продуктов в клетке. Частью этих усилий станет технология с высоким содержанием контента, которая может предоставить полезные инструменты для изучения того, где и когда действуют белки, выбивая их химическим путем.Это было бы наиболее полезно для гена, где мышей с нокаутом (с отсутствием одного или нескольких генов) невозможно получить, потому что белок необходим для развития, роста или иным образом летален, когда его нет. Химический нокаут может решить, как и где работают эти гены. В дальнейшем технология используется в сочетании сРНКи для идентификации наборов генов, участвующих в определенных механизмах, например делении клеток. Здесь библиотеки РНК, охватывающие весь набор предсказанных генов в геноме целевого организма, могут использоваться для идентификации соответствующих подмножеств, облегчая аннотацию генов, для которых заранее не установлена ​​четкая роль. Большие наборы данных, создаваемые автоматизированной клеточной биологией, содержат количественные данные с пространственным разрешением, которые можно использовать для построения моделей системного уровня и моделирования функционирования клеток и организмов. Модели системной биологии функции клетки позволили бы предсказать, почему, где и как клетка реагирует на внешние изменения, рост и болезнь.

История [ править ]

Технология высокопроизводительного скрининга позволяет оценивать множество биохимических и морфологических параметров в интактных биологических системах.

Для клеточных подходов полезность автоматизированной клеточной биологии требует изучения того, как автоматизация и объективные измерения могут улучшить экспериментирование и понимание болезни. Во-первых, он устраняет влияние исследователя в большинстве, но не во всех аспектах исследования клеточной биологии, а во-вторых, делает возможными совершенно новые подходы.

Итак, классическая клеточная биология 20-го века использовала клеточные линии, выращенные в культуре, где эксперименты были измерены с использованием очень похожего на описанное здесь, но там исследователь сделал выбор в отношении того, что и как измерять. В начале 1990-х годов разработка CCD- камер ( камер для устройств с зарядовой связью ) для исследований дала возможность измерять особенности изображений клеток, например, сколько белка находится в ядре, а сколько снаружи. Вскоре последовали сложные измерения с использованием новых флуоресцентных молекул, которые используются для измерения свойств клеток, таких как вторичный мессенджер.концентрации или pH внутренних компартментов клетки. Широкое использование зеленого флуоресцентного белка, молекулы природного флуоресцентного белка медузы, затем ускорило тенденцию к созданию изображений клеток как основной технологии в клеточной биологии. Несмотря на эти достижения, исследователь по-прежнему выбирал, какую ячейку отображать, какие данные представлять и как их анализировать.

По аналогии, если представить себе футбольное поле и накрытые на него обеденные тарелки, вместо того, чтобы смотреть на все, исследователь выберет горстку возле линии счета и должен будет оставить остальные. В этой аналогии поле представляет собой чашку для культивирования тканей, на пластинах - клетки, растущие на ней. Хотя это был разумный и прагматичный подход, автоматизация всего процесса и анализа делает возможным анализ всей популяции живых клеток, так что можно измерить все футбольное поле.

См. Также [ править ]

  • Открытие лекарств
  • Скрининг с высокой пропускной способностью
  • Открытие наркотиков привело к успеху
  • Микроскопия
  • Проточной цитометрии
  • Живое изображение одной клетки

Ссылки [ править ]

  1. Перейти ↑ Haney SA, ed. (2008). Скрининг высокого содержания: наука, методы и приложения . Нью-Йорк: Wiley-Interscience. ISBN 0-470-03999-X.
  2. Перейти ↑ Giuliano KA, Haskins JR, ed. (2010). Скрининг высокого содержания: мощный подход к системной клеточной биологии и открытию лекарств . Тотова, Нью-Джерси: Humana Press. ISBN 1-61737-746-5.
  3. Gasparri F (июнь 2009 г.). «Обзор клеточных фенотипов в HCS: ограничения и преимущества». Мнение эксперта об открытии лекарств . 4 (6): 643–657. DOI : 10.1517 / 17460440902992870 .
  4. ^ a b Varma H, Lo DC, Stockwell BR (2011). «Высокопроизводительный и содержательный скрининг терапевтических средств против болезни Хантингтона». В Lo DC, Hughes RE (ред.). Нейробиология болезни Хантингтона: приложения к открытию лекарств . Бока-Ратон, Флорида: CRC Press / Тейлор и Фрэнсис . Проверено 5 декабря 2018 .
  5. ^ Proll G, Steinle L, Pröll F, Kumpf M, Moehrle B, Mehlmann M, Gauglitz G (август 2007). «Возможность обнаружения отсутствия этикеток в приложениях для проверки высокого содержания». J Chromatogr . 1161 (1–2): 2–8. DOI : 10.1016 / j.chroma.2007.06.022 . PMID 17612548 . 
  6. ^ Burdine L, Kodadek T (май 2004). «Идентификация цели в химической генетике: (часто) недостающее звено» . Chem. Биол . 11 (5): 593–7. DOI : 10.1016 / j.chembiol.2004.05.001 . PMID 15157870 . 
  7. Eggert US, Mitchison TJ (июнь 2006 г.). «Скрининг малых молекул с помощью визуализации». Curr Opin Chem Biol . 10 (3): 232–7. DOI : 10.1016 / j.cbpa.2006.04.010 . PMID 16682248 . 

Дальнейшее чтение [ править ]

  • Абрахам В.К., Тейлор Д.Л., Хаскинс-младший (январь 2004 г.). «Скрининг высокого содержания применительно к крупномасштабной клеточной биологии». Trends Biotechnol . 22 (1): 15–22. DOI : 10.1016 / j.tibtech.2003.10.012 . PMID  14690618 .
  • Bleicher KH, Böhm HJ, Müller K, Alanine AI (май 2003 г.). «Хит и лидогенерация: за пределами высокопроизводительного скрининга». Nat Rev Drug Discov . 2 (5): 369–78. DOI : 10.1038 / nrd1086 . PMID  12750740 .
  • Бурдин Л., Кодадек Т. (май 2004 г.). «Идентификация цели в химической генетике: (часто) недостающее звено» . Chem. Биол . 11 (5): 593–7. DOI : 10.1016 / j.chembiol.2004.05.001 . PMID  15157870 .
  • Карпентер А.Е., Сабатини Д.М. (январь 2004 г.). «Систематический геномный скрининг функции генов». Nat. Преподобный Жене . 5 (1): 11–22. DOI : 10.1038 / nrg1248 . PMID  14708012 .
  • Эдвардс Б.С., Опреа Т., Просниц Э.Р., Скляр Л.А. (август 2004 г.). «Проточная цитометрия для высокопроизводительного скрининга с высоким содержанием». Curr Opin Chem Biol . 8 (4): 392–8. DOI : 10.1016 / j.cbpa.2004.06.007 . PMID  15288249 .
  • Сюй Г.В., Мауджи И.А., Макрэ С.Дж., Кох Калифорния, Датти А., Врана Д.Л., Деннис Дж.В., Шиммер А.Д. (март 2008 г.). «Химический скрининг с высоким содержанием позволяет идентифицировать эллиптицин как модулятор ядерной локализации р53». Апоптоз . 13 (3): 413–22. DOI : 10.1007 / s10495-007-0175-4 . PMID  18181020 .
  • Джулиано К.А., Хаскинс-младший, Тейлор Д.Л. (август 2003 г.). «Достижения в области скрининга высокого содержания для открытия лекарств». Assay Drug Dev Technol . 1 (4): 565–77. DOI : 10.1089 / 154065803322302826 . PMID  15090253 .
  • Лишевский, Кэти (2014). «Анализ высокого содержания:« Правильное »решение» . Gen. Eng. Biotechnol. Новости . 34 (3).
  • Миллиган Джи (июль 2003 г.). «Анализы с высоким содержанием лигандов для регуляции рецепторов, связанных с G-белком». Drug Discov. Сегодня . 8 (13): 579–85. DOI : 10.1016 / S1359-6446 (03) 02738-7 . PMID  12850333 .
  • Баттич Н., Штогер Т., Пелкманс Л. (октябрь 2013 г.). «Транскриптомика на основе изображений в тысячах отдельных клеток человека при разрешении одной молекулы». Методы природы . 10 (11): 1127–1133. DOI : 10.1038 / nmeth.2657 . PMID  24097269 .

Внешние ссылки [ править ]

  • Рекомендации по скринингу высокого содержания на основе изображений - NCBI
  • Общество биомолекулярной визуализации и информатики