Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

ЯМР нуклеиновых кислот - это использование спектроскопии ядерного магнитного резонанса для получения информации о структуре и динамике молекул нуклеиновых кислот , таких как ДНК или РНК . Это полезно для молекул длиной до 100 нуклеотидов, и по состоянию на 2003 год почти половина всех известных структур РНК была определена с помощью ЯМР-спектроскопии. [1]

ЯМР имеет преимущества перед рентгеновской кристаллографией , которая является другим методом определения структуры нуклеиновых кислот с высоким разрешением , в том, что молекулы наблюдаются в их естественном состоянии раствора, а не в кристаллической решетке, которая может влиять на структурные свойства молекулы. Также можно исследовать динамику с помощью ЯМР. Это происходит за счет немного менее точных и подробных структур, чем кристаллография. [2]

ЯМР нуклеиновых кислот использует методы, аналогичные методам ЯМР белков , но имеет несколько отличий. Нуклеиновые кислоты имеют меньший процент атомов водорода, которые обычно наблюдаются в ЯМР, и поскольку двойные спирали нуклеиновых кислот жесткие и примерно линейные, они не складываются сами по себе, давая «дальнодействующие» корреляции. Нуклеиновые кислоты также имеют тенденцию иметь резонансы, распределенные в меньшем диапазоне, чем белки, что делает спектры потенциально более насыщенными и трудными для интерпретации. [3]

Экспериментальные методы [ править ]

Двумерные методы ЯМР почти всегда используются с нуклеиновыми кислотами. К ним относятся корреляционная спектроскопия (COSY) и спектроскопия передачи полной когерентности (TOCSY) для обнаружения ядерных взаимодействий через сквозные связи и спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера (NOESY) для обнаружения взаимодействий между ядрами, которые находятся близко друг к другу в космосе. Типы ЯМР, обычно выполняемые с нуклеиновыми кислотами, включают 1 H ЯМР , 13 C ЯМР , 15 N ЯМР и 31 P ЯМР . 19 F ЯМР также полезен, если неприродные нуклеотиды, такие как 2'-фтор-2'-дезоксиаденозинвключены в цепь нуклеиновой кислоты, поскольку природные нуклеиновые кислоты не содержат атомов фтора. [2] [4]

1 H и 31 P имеют почти 100% естественное изобилие , в то время как 13 C и 15 N имеют низкое естественное изобилие. Для этих последних двух ядер существует возможность изотопного обогащения желаемых атомов в молекулах либо равномерно, либо сайт-специфическим образом. Нуклеотиды, равномерно обогащенные 13 C и / или 15 N, могут быть получены биохимическими методами путем проведения полимеразной цепной реакции с использованием dNTP или NTP, полученных из бактерий, выращенных в среде, обогащенной изотопами . Сайт-специфическое обогащение изотопов должно осуществляться путем химического синтеза меченого нуклеозид-фосфорамидита.мономера и полной нити ; однако их сложно и дорого синтезировать. [1] [5]

Поскольку нуклеиновые кислоты имеют относительно большое количество протонов, которые могут обмениваться растворителем, ЯМР нуклеиновых кислот обычно не проводят в растворителе D 2 O, как это обычно бывает с другими типами ЯМР. Это потому, что дейтерий в растворителе заменит обмениваемые протоны и погасит их сигнал. H 2O используется в качестве растворителя, и другие методы используются для устранения сильного сигнала растворителя, такие как насыщение сигнала растворителя перед нормальной последовательностью импульсов («предварительное насыщение»), что лучше всего работает при низкой температуре, чтобы предотвратить обмен протонами насыщенного растворителя. с протонами нуклеиновой кислоты; или возбуждение только интересующих резонансов («селективное возбуждение»), что имеет дополнительный, потенциально нежелательный эффект искажения амплитуд пиков. [2]

Определение структуры [ править ]

Обмениваемые и необмениваемые протоны обычно относят к их конкретным пикам как две независимые группы. Для обмениваемых протонов, которые по большей части являются протонами, участвующими в спаривании оснований , NOESY можно использовать для поиска корреляций в пространстве между соседними основаниями, что позволяет назначить целую дуплексную молекулу путем последовательного обхода.. Для необмениваемых протонов, многие из которых находятся на сахарной составляющей нуклеиновой кислоты, COSY и TOCSY используются для идентификации систем связанных ядер, в то время как NOESY снова используется для корреляции сахара с основанием и каждого основания с соседним основанием. Для необмениваемых протонов дуплексной ДНК протоны H6 / H8 на основании коррелируют со своими аналогами на соседних основаниях и с протоном H1 'на сахаре, что позволяет совершать последовательную ходьбу. Для РНК различия в химической структуре и геометрии спирали делают это отнесение технически более трудным, но все же возможным. Методология последовательной ходьбы невозможна ни для структур нуклеиновых кислот, не являющихся двойной спиралью, ни для формы Z-ДНК , что затрудняет определение резонансов. [2] [3]

Параметры, взятые из спектра, в основном кросс-пики NOESY и константы взаимодействия , можно использовать для определения локальных структурных особенностей, таких как углы гликозидной связи , двугранные углы (с использованием уравнения Карплюса ) и конформации сахарной складки. Наличие или отсутствие иминопротонных резонансов или связи между 15Атомы N через водородную связь указывает на наличие или отсутствие спаривания оснований. Для крупномасштабной структуры эти локальные параметры должны быть дополнены другими структурными допущениями или моделями, поскольку ошибки складываются при прохождении двойной спирали, и, в отличие от белков, двойная спираль не имеет компактной внутренней части и не сворачивается назад. сам. Однако информацию о дальнодействующей ориентации можно получить с помощью экспериментов по остаточному диполярному связыванию в среде, которая вызывает слабое выравнивание молекул нуклеиновой кислоты. [1] [2]

Недавно для определения структуры нуклеиновых кислот была внедрена методология твердотельного ЯМР . [6] Протокол предполагает два подхода: селективное маркирование РНК нуклеотидного типа и использование экспериментов по гетероядерной корреляции.

ЯМР также полезен для исследования нестандартных геометрических форм, таких как изогнутые спирали , спаривание оснований не-Ватсона – Крика и коаксиальное наложение . Это было особенно полезно при исследовании структуры природных олигонуклеотидов РНК, которые имеют тенденцию принимать сложные конформации, такие как стержневые петли и псевдоузлы.. Взаимодействия между РНК и ионами металлов можно исследовать с помощью ряда методов, включая наблюдение изменений химического сдвига при связывании иона, наблюдение уширения линии для парамагнитных типов ионов и наблюдение межмолекулярных контактов NOE для металлорганических имитаторов ионов металлов. ЯМР также полезен для исследования связывания молекул нуклеиновой кислоты с другими молекулами, такими как белки или лекарства. Это можно сделать с помощью карты химического сдвига, которая позволяет увидеть, какие резонансы сдвигаются при связывании другой молекулы, или с помощью экспериментов по перекрестному насыщению, когда одна из связывающих молекул селективно насыщается и, если она связана, насыщение переносится на другую. молекула в комплексе. [1] [2]

Динамические свойства , такие как дуплекс-одной нити равновесия и связывание скорости других молекул к дуплексам также могут быть определены путем его влиянием на спин-решеточной релаксации времени T 1 , но эти методы не чувствительны к промежуточным ставкам 10 4 -10 8 сек - 1 , который необходимо исследовать другими методами, такими как твердотельный ЯМР . Динамика механических свойств двойной спирали нуклеиновой кислоты, таких как изгиб и скручивание, также может быть изучена с помощью ЯМР. Эксперименты по ЯМР с импульсным градиентом поля можно использовать для измерения констант диффузии . [1] [2] [7]

История [ править ]

Исследования ЯМР нуклеиновых кислот проводились еще в 1971 г. [8] и были сосредоточены на использовании имино-протонных резонансов в слабом поле для исследования взаимодействий спаривания оснований. Эти ранние исследования были сосредоточены на тРНК, потому что эти нуклеиновые кислоты были единственными доступными в то время образцами с достаточно низкой молекулярной массой, чтобы значения ширины спектральных линий ЯМР были практичными. Исследование было сосредоточено на протонах с низким полем, потому что они были единственными протонами, которые можно было надежно наблюдать в водном растворе с использованием лучших спектрометров, доступных в то время. Быстро стало понятно, что спектры имино-протонов в слабом поле дают ключ к разгадке третичной структуры тРНК в растворе. Первый спектр ЯМР двойной спирали ДНК был опубликован в 1977 г. [9]с использованием синтетической двойной спирали из 30 пар оснований. Чтобы преодолеть резкое уширение линий в нативной ДНК, была приготовлена ​​полностью деградировавшая природная ДНК и изучена, чтобы узнать о длине персистентности двойной спиральной ДНК. [10] В то же время ядерные частицы нуклеосом были изучены, чтобы получить более полное представление о гибкости двойной спирали. [11] Первые спектры ЯМР для однородной низкомолекулярной ДНК с нативной последовательностью, полученной с помощью рестрикционных ферментов , были опубликованы в 1981 году. [12] Эта работа также была первым отчетом о спектрах ЯМР нуклеиновых кислот, полученных в сильном поле. Об исследованиях двумерного ЯМР начали сообщать в 1982 г. [13], а затем, с появлением синтеза олигонуклеотидов.и более сложное оборудование, многие подробные структурные исследования были опубликованы, начиная с 1983 г. [14]

Ссылки [ править ]

  1. ^ a b c d e Фюртиг, Борис; Рихтер, Кристиан; Wöhnert, Jens; Швальбе, Харальд (2003). «ЯМР-спектроскопия РНК». ChemBioChem . 4 (10): 936–962. DOI : 10.1002 / cbic.200300700 . PMID  14523911 .
  2. ^ Б с д е е г Wemmer, Дэвид (2000). «Глава 5: Структура и динамика ЯМР». В Блумфилде, Виктор А .; Crothers, Donald M .; Тиноко, Игнасио (ред.). Нуклеиновые кислоты: структура, свойства и функции . Саусалито, Калифорния: Научные книги университета. ISBN 0-935702-49-0.
  3. ^ a b Addess, Kenneth J .; Фейгон, Джули (1996). «Введение в 1 H ЯМР-спектроскопию ДНК». В Hecht, Сидней М. (ред.). Биоорганическая химия: нуклеиновые кислоты . Нью-Йорк: Издательство Оксфордского университета . ISBN 0-19-508467-5.
  4. ^ Кан, Лу-пой; Ц'о, Пол OP (1986). "Ядерно-магнитный резонанс нуклеиновых кислот". В Чиен, Шу; Хо, Чиен (ред.). ЯМР в биологии и медицине . Нью-Йорк: Raven Press. ISBN 0-88167-231-9.
  5. ^ Кодзима, C; Оно, А; Оно, А; Кайносё, М (2002). «Твердофазный синтез селективно меченой ДНК: приложения для многомерной спектроскопии ядерного магнитного резонанса». Методы в энзимологии . 338 : 261–283. DOI : 10.1016 / S0076-6879 (02) 38224-7 . PMID 11460552 . 
  6. ^ Marchanka, Александр; Саймон, Бернд; Альтхофф-Оспельт, Герхард; Карломаньо, Тереза ​​(2015). «Определение структуры РНК методом твердотельной ЯМР-спектроскопии» . Nature Communications . 6 : 7024. Bibcode : 2015NatCo ... 6E7024M . DOI : 10.1038 / ncomms8024 . PMC 4432599 . PMID 25960310 .  
  7. ^ Робинсон, BH; Дробный, ГП (1995). «[19] Сайт-специфическая динамика в ДНК: теория и эксперимент». Ядерный магнитный резонанс и нуклеиновые кислоты . Методы в энзимологии. 261 . С. 451–509. DOI : 10.1016 / S0076-6879 (95) 61021-9 . ISBN 978-0-12-182162-3. ISSN  0076-6879 .
  8. ^ Кирнс, Дэвид; Патель, Диншоу; Шульман, Роберт (1971). «Исследования ядерного магнитного резонанса высокого разрешения протонов тРНК в воде с водородной связью». Природа . 229 : 338–339. Bibcode : 1971Natur.229..338K . DOI : 10.1038 / 229338a0 .
  9. ↑ Рано, Томас; Кирнс, Дэвид; Берд, Джон; Ларсон, Жаклинн; Уэллс, Роберт (1977). «Исследование структурных и динамических свойств d (C15A15) · d (T15G15) с помощью протонного ядерного магнитного резонанса высокого разрешения». Биохимия . 16 (3): 541–551. DOI : 10.1021 / bi00622a031 .
  10. ↑ Рано, Томас; Кернс, Дэвид (1979). «1H ядерного магнитного резонанса исследование гибкости в ДНК» . PNAS . 76 (9): 4165–4169. Bibcode : 1979PNAS ... 76.4165E . DOI : 10.1073 / pnas.76.9.4165 . PMC 411531 . PMID 291958 .  
  11. ^ Фейгон, Джули; Кернс, Дэвид (1979). «ЯМР 1H исследование конформационных состояний ДНК в ядрах нуклеосомных частиц» . Исследования нуклеиновых кислот . 6 : 2327–2337. DOI : 10.1093 / NAR / 6.6.2327 . PMC 327853 . PMID 461191 .  
  12. ↑ Рано, Томас; Кирнс, Дэвид; Хиллен, Вольфганг; Уэллс, Роберт (1980). "Исследование протонного ЯМР 300 МГц и 600 МГц фрагмента рестрикции из 12 пар оснований: исследование структуры путем релаксационных измерений" . Исследования нуклеиновых кислот . 8 : 5795–5812. DOI : 10.1093 / NAR / 8.23.5795 . PMC 324342 . PMID 6258152 .  
  13. ^ Фейгон, Джули; Райт, Джон; Леупен, Вернер; Денни, Вашингтон; Кернс, Дэвид (1982). «Использование двумерного ЯМР в исследовании двухцепочечной ДНК». Варенье. Chem. Soc . 104 (20): 5540–5541. DOI : 10.1021 / ja00384a069 .
  14. ^ Адрес, Кеннет; Фейгон, Джули (1996). «Введение в 1H ЯМР-спектроскопию ДНК». В Hecht, Сидней (ред.). Биоорганическая химия: нуклеиновые кислоты . Нью-Йорк: Издательство Оксфордского университета. ISBN 0-19-508467-5.