В генетике, floxing относится к части многослойным композитным в ДНК последовательности (которая затем указанного быть floxed ) между двумя LOX P сайтами. Эти термины построены на фразе «фланговый / фланговый LoxP». Рекомбинация между сайтами LoxP катализируется рекомбиназой Cre . Флоксирование гена позволяет ему быть удаленным (нокаутированным), перемещенным или инвертированным в процессе, называемом рекомбинацией Cre-Lox . [1] Флоксирование генов имеет важное значение при разработке научных модельных систем, поскольку позволяет исследователям иметь пространственное и временное изменение экспрессии генов. [2]Более того, животных, таких как мыши, можно использовать в качестве моделей для изучения болезней человека. Таким образом, систему Cre-lox можно использовать на мышах для управления экспрессией генов с целью изучения заболеваний человека и разработки лекарств. [3] Например, используя систему Cre-lox, исследователи могут изучать онкогены и гены-супрессоры опухолей и их роль в развитии и прогрессировании рака на моделях мышей. [4]
Использование в исследованиях
Флоксирование гена позволяет ему быть удаленным (нокаутированным), [5] [6] транслоцированным или вставленным [7] (посредством различных механизмов в рекомбинации Cre-Lox).
Флоксирование генов имеет важное значение при разработке научных модельных систем, поскольку оно позволяет изменять экспрессию генов в пространстве и во времени. С точки зрения непрофессионала, ген может быть отключен (инактивирован) в конкретной ткани in vivo в любое время по выбору ученого. Затем ученый может оценить эффекты нокаутированного гена и определить нормальную функцию гена [8] . Это отличается от отсутствия гена с момента зачатия, когда инактивация или потеря генов, необходимых для развития организма, может нарушить нормальное функционирование клеток и предотвратить образование жизнеспособного потомства. [9]
Механизм удаления
События удаления полезны для проведения экспериментов по редактированию генов посредством точного редактирования сегментов или даже целых генов. Удаление требует объединения интересующего сегмента с сайтами loxP, которые обращены в одном направлении. Рекомбиназа Cre будет обнаруживать однонаправленные сайты loxP и вырезать флоксированный сегмент ДНК. [10] Успешно отредактированные клоны можно выбрать с помощью маркера выбора, который можно удалить с помощью той же системы Cre-loxP. [10] Тот же механизм можно использовать для создания условных аллелей путем введения сайта FRT / Flp, который выполняет тот же механизм, но с другим ферментом.
Механизм инверсии
События инверсии полезны для поддержания количества генетического материала. Инвертированные гены не часто связаны с аномальными фенотипами , что означает, что инвертированные гены обычно жизнеспособны. [11] Для рекомбинации Cre-loxP, которая приводит к встраиванию, требуются сайты loxP для объединения интересующего гена, при этом сайты loxP ориентированы друг на друга. Проходя Cre-рекомбинацию, область, флоксируемая сайтами loxP, становится инвертированной [12], этот процесс не является постоянным и может быть обращен вспять. [13]
Механизм транслокации
События транслокации происходят, когда loxP размещает гены flox на двух разных молекулах ДНК в однонаправленной ориентации. Затем Cre-рекомбиназа используется для создания транслокации между двумя молекулами ДНК, обменивая генетический материал от одной молекулы ДНК на другую, образуя одновременную транслокацию обоих флоксованных генов. [14] [15]
Общие приложения в исследованиях
Было показано, что кардиомиоциты (ткань сердечной мышцы) экспрессируют тип рекомбиназы Cre, который очень специфичен для кардиомиоцитов и может использоваться исследователями для выполнения высокоэффективных рекомбинаций. Это достигается за счет использования типа Cre, выражение которого определяетсяпромотор тяжелой цепи миозина (-MyHC) . Эти рекомбинации способны разрушать гены способом, специфичным только для сердечной ткани in vivo, и позволяют создавать условные нокауты сердца, в основном для использования в качестве контроля. [16]
Например, используя рекомбиназу Cre с-Промотор MyHC вызывает инактивацию гена floxed только в сердце. Кроме того, эти выбивки могут быть индуцируемыми. В нескольких исследованиях на мышах тамоксифен используется для индукции рекомбиназы Cre . [17] [18] В этом случае Cre-рекомбиназа сливается с частью рецептора эстрогена мыши (ER), который содержит мутацию в его лиганд-связывающем домене (LBD) . Мутация делает рецептор неактивным, что приводит к неправильной локализации из-за его взаимодействия с белками-шаперонами, такими как белок теплового шока 70 и 90 ( Hsp70 и Hsp90 ). Тамоксифен связывается с Cre-ER и нарушает его взаимодействия с шаперонами, что позволяет слитому белку Cre-ER проникать в ядро и выполнять рекомбинацию на флоксованном гене. [19] [20] Кроме того, Cre-рекомбиназа может быть индуцирована теплом, когда она находится под контролем специфических элементов теплового шока (HSE). [21] [22]
Рекомендации
- Перейти ↑ Nagy A (февраль 2000 г.). «Cre-рекомбиназа: универсальный реагент для адаптации генома» . Бытие . 26 (2): 99–109. DOI : 10.1002 / (SICI) 1526-968X (200002) 26: 2 <99 :: AID-GENE1> 3.0.CO; 2-B . PMID 10686599 . S2CID 2916710 .
- ^ Хаяши С., МакМахон А.П. (апрель 2002 г.). «Эффективная рекомбинация в различных тканях с помощью индуцируемой тамоксифеном формы Cre: инструмент для временно регулируемой активации / инактивации генов у мышей». Биология развития . 244 (2): 305–18. DOI : 10.1006 / dbio.2002.0597 . PMID 11944939 .
- ^ Генетика мышей: методы и протоколы . Сингх, Шри Рам, Коппола, Винченцо. Нью-Йорк, штат Нью-Йорк. ISBN 9781493912155. OCLC 885338722 .CS1 maint: другие ( ссылка )
- ^ Грин Дж. Э., Рид Т. (2012). Генно-инженерные мыши для исследования рака . DOI : 10.1007 / 978-0-387-69805-2 . ISBN 978-0-387-69803-8.
- ^ Friedel RH, Wurst W., Wefers B, Kühn R (2011). «Создание мышей с условным нокаутом». Методы и протоколы трансгенных мышей . Методы молекулярной биологии. 693 . С. 205–31. DOI : 10.1007 / 978-1-60761-974-1_12 . ISBN 978-1-60761-973-4. PMID 21080282 .
- ^ Сакамото К., Гурумурти CB, Вагнер К. (2014), Сингх С.Р., Коппола В. (ред.), «Генерация мышей с условным нокаутом», Mouse Genetics , Springer New York, 1194 , стр. 21–35, DOI : 10.1007 / 978 -1-4939-1215-5_2 , ISBN 9781493912148, PMID 25064096
- ^ Имута Й., Кийонари Х., Джанг Ч.В., Берингер Р.Р., Сасаки Х. (март 2013 г.). «Получение мышей knock-in, которые экспрессируют зеленый флуоресцентный белок с ядерным усилением и рекомбиназу Cre, индуцируемую тамоксифеном, в хорде из локусов Foxa2 и T» . Бытие . 51 (3): 210–8. DOI : 10.1002 / dvg.22376 . PMC 3632256 . PMID 23359409 .
- ^ Зал B, Limaye A, Kulkarni AB (сентябрь 2009 г.). «Обзор: поколение мышей с нокаутом генов» . Текущие протоколы в клеточной биологии . Глава 19: Блок 19.12 19.12.1–17. DOI : 10.1002 / 0471143030.cb1912s44 . PMC 2782548 . PMID 19731224 .
- ^ Родригес СП, Шахнович Е.И. (01.08.2019). «Адаптация к мутационной инактивации важного гена E. coli сводится к доступному субоптимальному пику приспособленности» . bioRxiv : 552240. дои : 10,1101 / 552240 .
- ^ а б Швенк Ф., Барон У., Раевский К. (декабрь 1995 г.). «Cre-трансгенный штамм мышей с повсеместной делецией генных сегментов, фланкированных loxP, включая делецию в зародышевых клетках» . Исследования нуклеиновых кислот . 23 (24): 5080–1. DOI : 10.1093 / NAR / 23.24.5080 . PMC 307516 . PMID 8559668 .
- ^ Гриффитс AJ, Миллер JH, Suzuki DT, Lewontin RC, Gelbart WM (2000). «Инверсии» . Введение в генетический анализ. 7-е издание .
- ^ Сюй Дж, Чжу Ю (август 2018). «Быстрый метод in vitro для переворота двойной флоксированной перевернутой открытой рамки считывания в плазмиде» . BMC Biotechnology . 18 (1): 52. DOI : 10,1186 / s12896-018-0462-х . PMC 6119287 . PMID 30170595 .
- ^ Обердорффер П., Отипобы К.Л., Маруяма М., Раевский К. (ноябрь 2003 г.). «Однонаправленная Cre-опосредованная генетическая инверсия у мышей с использованием мутантной пары loxP lox66 / lox71» . Исследования нуклеиновых кислот . 31 (22): 140e – 140. DOI : 10.1093 / NAR / gng140 . PMC 275577 . PMID 14602933 .
- ^ Сюй Дж, Чжу Ю (август 2018). «Быстрый метод in vitro для переворота двойной флоксированной перевернутой открытой рамки считывания в плазмиде» . BMC Biotechnology . 18 (1): 52. DOI : 10,1186 / s12896-018-0462-х . PMC 6119287 . PMID 30170595 .
- ^ Гриффитс AJ, Миллер JH, Suzuki DT, Lewontin RC, Gelbart WM (2000). «Транслокации». Введение в генетический анализ (7-е изд.).
- ^ Пугач Е.К., Ричмонд П.А., Азофейфа Дж. Г., Доуэлл Р.Д., Лейнванд Л.А. (сентябрь 2015 г.). «Длительная экспрессия Cre, управляемая промотором тяжелой цепи α-миозина, может быть кардиотоксичной» . Журнал молекулярной и клеточной кардиологии . 86 : 54–61. DOI : 10.1016 / j.yjmcc.2015.06.019 . PMC 4558343 . PMID 26141530 .
- ^ Хаяши С., МакМахон А.П. (апрель 2002 г.). «Эффективная рекомбинация в различных тканях с помощью индуцируемой тамоксифеном формы Cre: инструмент для временно регулируемой активации / инактивации генов у мышей». Биология развития . 244 (2): 305–18. DOI : 10.1006 / dbio.2002.0597 . PMID 11944939 .
- ^ Хаяши С., МакМахон А.П. (апрель 2002 г.). «Эффективная рекомбинация в различных тканях с помощью индуцируемой тамоксифеном формы Cre: инструмент для временно регулируемой активации / инактивации генов у мышей». Биология развития . 244 (2): 305–18. DOI : 10.1006 / dbio.2002.0597 . PMID 11944939 .
- ^ Даниэлян П.С., Муччино Д., Рович Д.Х., Майкл С.К., МакМахон А.П. (декабрь 1998 г.). «Модификация активности гена в эмбрионах мыши в утробе матери с помощью индуцируемой тамоксифеном формы рекомбиназы Cre». Текущая биология . 8 (24): 1323–6. DOI : 10.1016 / s0960-9822 (07) 00562-3 . PMID 9843687 .
- ^ Методы трансгенеза: принципы и протоколы . Кларк, Алан Р. (2-е изд.). Тотова, Нью-Джерси: Humana Press. 2002. ISBN. 9781592591787. OCLC 50175106 .CS1 maint: другие ( ссылка )
- ^ Рак и рыбки данио: механизмы, методы и модели . Лангенау, Дэвид М. Швейцария. ISBN 9783319306544. OCLC 949668674 .CS1 maint: другие ( ссылка )
- ^ Кобаяси К., Камей Ю., Киношита М., Черни Т., Танака М. (январь 2013 г.). «Индуцируемая нагреванием система индукции гена CRE / LOXP в медаке». Бытие . 51 (1): 59–67. DOI : 10.1002 / dvg.22348 . PMID 23019184 .