Иммунофлуоресцентный поляризационный иммуноанализ (FPIA) - это класс биохимических тестов in vitro, используемых для быстрого обнаружения антител или антигенов в образце. FPIA - это конкурентный гомогенный анализ , который состоит из простого метода подготовки и считывания без необходимости этапов разделения или промывки.
В основе анализа лежит анизотропия флуоресценции , также известная как поляризация флуоресценции. Если флуоресцентная молекула неподвижна и подвергается воздействию плоскополяризованного света , она возбуждается и, следовательно, испускает излучение обратно в поляризованную плоскость. Однако, если возбужденная флуоресцентная молекула находится в движении (вращательном или поступательном) в течение времени жизни флуоресценции, она будет излучать свет в направлении, отличном от плоскости возбуждения. Время жизни флуоресценции - это время между моментом поглощения и моментом флуоресцентного излучения.
Обычно скорость вращения молекулы указывает на ее размер. [1] Когда молекула с флуоресцентной меткой (индикатор) связывается с другой молекулой, вращательное движение изменяется, что приводит к изменению интенсивности плоско-поляризованного света, что приводит к изменению поляризации флуоресценции. [2] В иммуноанализе с поляризацией флуоресценции используется связанный с флуорофором антиген, который при связывании с представляющим интерес антителом увеличивает поляризацию флуоресценции. Изменение поляризации пропорционально количеству антигена в образце и измеряется анализатором поляризации флуоресценции. [3]
История
Поляризацию флуоресценции впервые наблюдал Ф. Вейгерт в 1920 году. Он экспериментировал с растворами флуоресцеина, эозина и других красителей при различных температурах и вязкости. Заметив, что поляризация увеличивается с вязкостью растворителя и размером молекулы красителя, но уменьшается с увеличением температуры, он пришел к выводу, что поляризация увеличивается с уменьшением подвижности излучающих частиц. [2] С 1925 по 1926 год Фрэнсис Перрен подробно описал количественную теорию поляризации флуоресценции в нескольких важных публикациях, актуальных и по сей день. [2]
Так как вклад Перрина, техник вырос из определения связывания изотермы под жестким контролем параметров, к изучению антигена - антитела , небольшие молекулы - белка , а также гормон - рецептор взаимодействий связывания. [4] Иммуноферментный флуоресцентный поляризационный иммуноанализ был впервые описан и использован в 1960-х годах. [5] [6] Конкурентная гомогенная характеристика позволила автоматизировать флуоресцентный поляризационный иммуноанализ намного проще, чем другие методы иммуноанализа, такие как радиоиммуноанализ или иммуноферментный анализ . [4]
Несмотря на то, что этот метод возник как метод исследования прямого взаимодействия, с середины 1990-х годов этот метод был принят методом высокопроизводительного скрининга, чтобы облегчить процесс открытия лекарств путем изучения сложного ферментативного взаимодействия . [4]
Принцип
FPIA количественно определяет изменение поляризации флуоресценции реакционных смесей флуоресцентно меченого индикатора, образца антигена и определенного антитела . Работа при фиксированной температуре и вязкости позволяет поляризации флуоресценции быть прямо пропорциональной размеру флуорофора. Свободный индикатор в растворе имеет более низкую поляризацию флуоресценции, чем связанный с антителом индикатор с более медленным броуновским движением . Индикатор и специфический антиген будут конкурировать за связывание с антителом, и если концентрация антигена низкая, с антителом будет связываться большее количество индикатора, что приведет к более высокой поляризации флуоресценции и наоборот. [7]
Обычный FPIA следует процедуре, описанной ниже:
- В реакционный буфер добавляется определенное количество образца.
- Раствору дают возможность уравновеситься при комнатной температуре в течение примерно двух минут.
- Раствор оценивается в анализаторе поляризации флуоресценции для получения базового измерения.
- В раствор добавляется определенное количество антигена, конъюгированного с флуорофором.
- Раствор снова уравновешивается примерно в течение двух минут.
- Раствор снова оценивается анализатором поляризации флуоресценции.
- Значение поляризации флуоресценции для раствора, содержащего индикатор, сравнивается с базовой линией, а величина различия пропорциональна количеству целевого аналита в образце. [1]
Приложения
FPIA стал жизнеспособным методом количественного определения малых молекул в смесях, включая пестициды , [8] микотоксины [9] в пищевых продуктах, фармацевтические соединения в сточных водах, [10] метаболиты в моче и сыворотке, указывающие на употребление наркотиков ( каннабиноиды , амфетамины). , барбитураты , кокаин , бензодиазепины , метадон , опиаты и PCP ), [11] [12] и другие низкомолекулярные токсины . Так же как и с анализом гормон - рецептор взаимодействий. [4]
Смотрите также
- ELISA
- Радиоиммуноанализ
- FRET
- Магнитный иммуноферментный анализ
- Флуоресценция
- Иммуноскрининг
- Испытание бокового потока
- Клонированный иммуноферментный иммуноферментный анализ
- Иммуноферментный анализ оптического волокна
- Считыватель планшетов
Рекомендации
- ^ а б Нильсен К., Лин М., Галл Д., Джолли М. (сентябрь 2000 г.). «Иммуноферментный флуоресцентный поляризационный анализ: обнаружение антител к Brucella abortus». Методы . 22 (1): 71–6. DOI : 10,1006 / meth.2000.1038 . PMID 11020320 .
- ^ а б в Джеймсон Д. (2003). «Поляризация флуоресценции: прошлое, настоящее и будущее». Комбинаторная химия и высокопроизводительный скрининг . 6 (3): 167–176. DOI : 10.2174 / 138620703106298347 . PMID 12678695 - через ResearchGate.
- ^ Попелка С (1981). «Иммуноферментный анализ флуоресценции с поляризацией II. Анализатор для быстрого и точного измерения поляризации флуоресценции с использованием одноразовых кювет» . Clin Chem . 27 : 1198–1201. DOI : 10.1093 / clinchem / 27.7.1198 .
- ^ а б в г Леа В.А., Симеонов А. (январь 2011 г.). «Анализ поляризации флуоресценции в скрининге малых молекул» . Мнение эксперта об открытии лекарств . 6 (1): 17–32. DOI : 10.1517 / 17460441.2011.537322 . PMC 3277431 . PMID 22328899 .
- ^ Ватанабэ Ф (1988). Теория и применение флуоресцентного поляризационного иммуноанализа . Нью-Йорк: Пленум Пресс. С. 199–200.
- ^ Насир М (1999). «Поляризация флуоресценции: аналитический инструмент для иммуноанализа и открытия лекарств». Комбинаторная химия и высокопроизводительный скрининг . 2 (4): 177–190. PMID 10469879 - через ResearchGate.
- ^ Смит Д.С., Еремин С.А. (июль 2008 г.). «Флуоресцентные поляризационные иммуноанализы и родственные методы для простого и высокопроизводительного скрининга малых молекул». Аналитическая и биоаналитическая химия . 391 (5): 1499–507. DOI : 10.1007 / s00216-008-1897-Z . PMID 18264817 . S2CID 24167641 .
- ^ Еремин С.А., Смит Д.С. (май 2003 г.). «Флуоресцентный поляризационный иммуноанализ пестицидов». Комбинаторная химия и высокопроизводительный скрининг . 6 (3): 257–66. DOI : 10.2174 / 138620703106298301 . PMID 12678704 .
- ^ Марагос С. (декабрь 2009 г.). «Флуоресцентный поляризационный иммуноферментный анализ микотоксинов: обзор» . Токсины . 1 (2): 196–207. DOI : 10,3390 / toxins1020196 . PMC 3202780 . PMID 22069541 .
- ^ Оберлейтнер Л., Дамен-Левисон Ю., Гарбе Л.А., Шнайдер Р.Дж. (май 2017 г.). «Применение флуоресцентного поляризационного иммуноанализа для определения карбамазепина в сточных водах». Журнал экологического менеджмента . 193 : 92–97. DOI : 10.1016 / j.jenvman.2017.01.063 . PMID 28192740 .
- ^ Рэми К.Л., Ковач С.Дж., Мартин Д.Е., Йоркаски Д.К. (май 1998 г.). «Результаты скрининга мочи на наркотики добровольцами в рамках клинических фармакологических исследований фазы I: вводят ли мы в заблуждение?». Журнал клинической фармакологии . 38 (5): 413–6. DOI : 10.1002 / j.1552-4604.1998.tb04445.x . PMID 9602952 . S2CID 21496845 .
- ^ Эдмондс Д. (12 декабря 2000 г.). «Метод диагностики иммуноферментного флуоресцентного поляризационного анализа US 6159750A» . Патенты Google . Проверено 6 апреля 2017 года .