Среда НАТА ( гипоксантин - аминоптерин - тимидин среды ) является селективной средой для культивирования клеток млекопитающих, который основан на комбинации аминоптерина , препарат , который действует как мощный фолата ингибитор метаболизма путем ингибирования дигидрофолатредуктазы , с гипоксантин (а пуриновая производной) и тимидина (а дезокси нуклеозид ) , которые являются промежуточными продуктами в синтезе ДНК . Хитрость в том, что аминоптерин блокирует синтез ДНК de novo , который абсолютно необходим для деления клеток.чтобы продолжить, но гипоксантин и тимидин обеспечивают клетки сырьем, чтобы избежать блокировки («путь спасения»), при условии, что у них есть правильные ферменты , что означает наличие функционирующих копий генов, которые их кодируют.
Фермент дигидрофолатредуктаза , который производит тетрагидрофолат (THF) путем восстановления дигидрофолата, специфически блокируется аминоптерином. THF, действуя в сочетании со специфическими белками , может получать единичные углеродные единицы, которые затем переносятся на определенные мишени.
Одной из важных мишеней для клеточного воспроизводства является тимидилатсинтаза , которая создает тимидинмонофосфат (ТМФ) из дезоксиуридинмонофосфата (dUMP). Путем дополнительных реакций фосфорилирования TMP можно использовать для получения тимидинтрифосфата (TTP), одного из четырех предшественников нуклеотидов, которые используются ДНК-полимеразами для создания ДНК . Без ТГФ, необходимого для преобразования dUMP, не может быть ТТФ, и синтез ДНК не может продолжаться, если ТМФ не может быть произведен из другого источника. Альтернативным источником является тимидин, присутствующий в среде HAT, который может абсорбироваться клетками и фосфорилироваться посредствомтимидинкиназы (ТК) в ТМП.
Синтез IMP (предшественник GMP и GTP, а также AMP и ATP) также требует THF, и его также можно обойти. В этом случае гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза (HGPRT) реагирует на гипоксантин, абсорбированный из среды, с PRPP , высвобождая пирофосфат , с образованием IMP путем спасения.
Следовательно, использование среды HAT для культивирования клеток является формой искусственного отбора клеток, содержащих рабочие TK и HGPRT. Многие полезные усовершенствования схемы стали возможны благодаря ядам, которые убивают клетки, но к которым они невосприимчивы, если у них отсутствует один из этих генов. Таким образом, клетка, лишенная TK, устойчива к бромдезоксиуридину (BrdU), а клетка, лишенная HGPRT, устойчива к 6-тиогуанину (6-TG) и 8-азагуанину . Таким образом, отбор с использованием одного из последних двух препаратов с последующей средой HAT приведет к образованию ревертантных колоний. [1]
Приложения [ править ]
Среда HAT часто используется для получения моноклональных антител . Этот процесс называется гибридомной технологией . Лабораторные животные (например, мыши) сначала подвергаются воздействию антигена, против которого мы хотим выделить антитело . После выделения спленоцитов от млекопитающего B-клетки сливаются с HGPRT-отрицательными иммортализованными миеломными клетками с использованием полиэтиленгликоля или вируса Сендай . Слитые клетки инкубируют в среде HAT . Аминоптерин в среде блокирует de novoпуть. Следовательно, неслитые миеломные клетки умирают, поскольку они не могут продуцировать нуклеотиды путем de novo или спасения. Неслитые В-клетки умирают, поскольку имеют короткую продолжительность жизни. Таким образом, выживают только гибриды В-клетки и миеломы. Эти клетки вырабатывают антитела (свойство В-клеток) и бессмертны (свойство миеломных клеток). Затем инкубированную среду разводят в многолуночных планшетах до такой степени, чтобы каждая лунка содержала только 1 клетку. Затем супернатант в каждой лунке можно проверить на наличие желаемого антитела. Поскольку антитела в лунке продуцируются одной и той же В-клеткой, они будут направлены на один и тот же эпитоп и известны как моноклональные антитела .
Производство моноклональных антител было впервые изобретено Сезаром Мильштейном и Жоржем Дж. Ф. Келером , что принесло им Нобелевскую премию по физиологии и медицине 1984 года, разделенную с Нильсом Кай Йерне .
Ссылки [ править ]
- ^ Холлидей, R; Хо, Т. «доказательства молчания генов за счет эндогенного метилирования» . Proc Natl Acad Sci USA . 95 : 8727–32. DOI : 10.1073 / pnas.95.15.8727 . PMC 21144 . PMID 9671746 .
