Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Эта статья о биотехнологическом методе. Для естественного процесса в клетках см. Выражение генов .
Центральная догма, изображающая транскрипцию от кода ДНК к коду РНК к белкам на втором этапе, охватывающем производство белка.
Центральная догма, изображающая транскрипцию от кода ДНК к коду РНК к белкам на втором этапе, охватывающем производство белка.

Производство белка - это биотехнологический процесс производства определенного белка . Обычно это достигается манипулированием экспрессией гена в организме таким образом, чтобы он экспрессировал большие количества рекомбинантного гена . Это включает в себя транскрипцию из рекомбинантной ДНК к матричной РНК ( мРНК ), в переводе мРНК в полипептидных цепей, которые в конечном счете , сложенными в функциональные белки и может быть целевых к конкретным субклеточном или внеклеточных местах. [1]

Системы производства белка (на лабораторном жаргоне также называемые «системами экспрессии») используются в науках о жизни , биотехнологии и медицине . В молекулярно-биологических исследованиях используются многочисленные белки и ферменты, многие из которых происходят из систем экспрессии; в частности, ДНК-полимераза для ПЦР , обратная транскриптаза для анализа РНК, эндонуклеазы рестрикции для клонирования и создание белков, которые проверяются при открытии лекарств как биологические мишени или как сами потенциальные лекарства. Системы экспрессии также находят широкое применение в промышленной ферментации., в частности, производство биофармацевтических препаратов, таких как человеческий инсулин, для лечения диабета и производства ферментов .

Системы производства белка [ править ]

Обычно системы производства б белка включают те , которые получены из бактерий , [2] дрожжей , [3] [4] бакуловирус / насекомое , [5] млекопитающих клетки, [6] [7] и совсем недавно нитчатые грибы , такие как Myceliophthora thermophila . [8] Когда биофармацевтические препараты производятся с использованием одной из этих систем, связанные с процессом примеси, называемые белками клетки-хозяина, также попадают в конечный продукт в следовых количествах. [9]

Системы на основе клеток [ править ]

Самые старые и наиболее широко используемые системы экспрессии основаны на клетках и могут быть определены как « комбинация вектора экспрессии , его клонированной ДНК и хозяина для вектора, которые обеспечивают контекст, позволяющий чужеродному гену функционировать в клетке-хозяине, что есть, производить белки на высоком уровне ». [10] [11] Сверхэкспрессия - это аномально и чрезмерно высокий уровень экспрессии гена, который приводит к выраженному фенотипу, связанному с генами . [12] [13]

Есть много способов ввести чужеродную ДНК в клетку для экспрессии, и для экспрессии можно использовать множество разных клеток-хозяев - каждая система экспрессии имеет определенные преимущества и недостатки. На системы экспрессии обычно ссылаются хозяин и источник ДНК или механизм доставки генетического материала. Например, обычными хозяевами являются бактерии (такие как E.coli , B. subtilis ), дрожжи (такие как S.cerevisiae [4] ) или линии эукариотических клеток . Обычными источниками ДНК и механизмами доставки являются вирусы (например, бакуловирус , ретровирус ,аденовирус ), плазмиды , искусственные хромосомы и бактериофаги (например, лямбда ). Наилучшая система экспрессии зависит от задействованного гена , например, Saccharomyces cerevisiae часто предпочтительнее для белков, требующих значительной посттрансляционной модификации . Линии клеток насекомых или млекопитающих используются, когда требуется сплайсинг мРНК, подобный человеку. Тем не менее, бактериальная экспрессия имеет то преимущество, что легко продуцирует большое количество белка, что требуется для рентгеновской кристаллографии или ядерного магнитного резонанса. эксперименты по определению структуры.

Поскольку бактерии являются прокариотами , они не оснащены полным ферментативным механизмом для выполнения необходимых посттрансляционных модификаций или молекулярного фолдинга. Следовательно, мультидоменные эукариотические белки, экспрессируемые в бактериях, часто нефункциональны. Кроме того, многие белки становятся нерастворимыми в виде телец включения, которые трудно восстановить без резких денатурирующих агентов и последующего обременительного рефолдинга белка.

Для решения этих проблем были разработаны системы экспрессии с использованием нескольких эукариотических клеток для приложений, требующих, чтобы белки соответствовали эукариотическим организмам или были ближе к ним: клетки растений (например, табака), насекомых или млекопитающих (например, крупного рогатого скота) трансфицировали генами и культивируют в суспензии и даже в виде тканей или целых организмов для получения полностью свернутых белков. Однако системы экспрессии млекопитающих in vivo имеют низкий выход и другие ограничения (трудоемкость, токсичность для клеток-хозяев и т. Д.). Чтобы объединить высокую урожайность / продуктивность и масштабируемые белковые свойства бактерий и дрожжей, а также расширенные эпигенетические особенности систем растений, насекомых и млекопитающих, другие системы производства белка разработаны с использованием одноклеточных эукариот (т.е. непатогенных « лейшманий»).клетки).

Бактериальные системы [ править ]

Кишечная палочка [ править ]
E. coli , один из самых популярных хозяев для искусственной экспрессии генов.

E. coli является одним из наиболее широко используемых хозяев для экспрессии, и ДНК обычно вводят ввектор экспрессии плазмиды . Методы сверхэкспрессии в E. coli хорошо разработаны и работают за счет увеличения числа копий гена или увеличения силы связывания промоторной области, что способствует транскрипции.

Например, последовательность ДНК представляющего интерес белка может быть клонирована или субклонирована в плазмиду с большим числом копий, содержащую промотор lac (часто LacUV5 ), которая затем трансформируется в бактерию E. coli . Добавление IPTG ( аналог лактозы ) активирует промотор lac и заставляет бактерии экспрессировать интересующий белок.

Штаммы E. coli BL21 и BL21 (DE3) - это два штамма, обычно используемые для производства белка. Как представители линии B, они лишены протеаз lon и OmpT , защищающих продуцируемые белки от деградации. Профаг DE3, обнаруженный в BL21 (DE3), обеспечивает РНК-полимеразу T7 (управляемую промотором LacUV5), что позволяет использовать вместо этого векторы с промотором T7. [14]

Коринебактерии [ править ]

Непатогенные виды грамположительных коринебактерий используются для коммерческого производства различных аминокислот. В С.glutamicum , вид широко используется для производства глутамата и лизина , [15] компоненты человеческой пищи, кормов для животных и фармацевтических продуктов.

Выражение функционально активный человеческий эпидермальный фактор роста было сделано в С.glutamicum , , [16] , таким образом , демонстрируя потенциал для промышленного масштаба производства белков человека. Экспрессированные белки могут быть нацелены на секрецию либо через общий секреторный путь (Sec), либо через путь транслокации двойного аргинина (Tat). [17]

В отличие от грамотрицательных бактерий , у грамположительных Corynebacterium отсутствуют липополисахариды, которые у человека действуют как антигенные эндотоксины .

Pseudomonas fluorescens [ править ]

Непатогенные и грамотрицательные бактерии, Pseudomonas fluorescens , используются для производства рекомбинантных белков на высоком уровне; обычно для разработки биотерапевтических препаратов и вакцин. P. fluorescens - это метаболически разносторонний организм, позволяющий проводить высокопроизводительный скрининг и быстрое развитие сложных белков. P. fluorescens наиболее известен своей способностью быстро и успешно производить высокие титры активного растворимого белка. [18]

Эукариотические системы [ править ]

Дрожжи [ править ]

Системы экспрессии, использующие S. cerevisiae или Pichia pastoris, обеспечивают стабильное и продолжительное производство белков, которые обрабатываются аналогично клеткам млекопитающих с высоким выходом в белковых средах с определенным химическим составом.

Нитчатые грибы [ править ]

Нитчатые грибы, особенно Aspergillus и Trichoderma , а также в последнее время Myceliophthora thermophila C1 [8] , превратились в платформы экспрессии для скрининга и производства различных промышленных ферментов . Система экспрессии C1 демонстрирует морфологию низкой вязкости в погруженной культуре, что позволяет использовать сложные среды для выращивания и продуцирования.

Бакуловирус -infected клетки [ править ]
См. Также: BacMam

Бакуловирусом -infected клетки насекомых [19] ( Sf9 , Sf21 , High Five штаммы) или клетки млекопитающих [20] ( HeLa , НЕК 293 ) позволяют производить гликозилированных или мембранных белков , которые не могут быть получены с помощью грибковой или бактериальной системы. [19] Это полезно для производства белков в больших количествах. Гены не экспрессируются постоянно, потому что инфицированные клетки-хозяева в конечном итоге лизируются и умирают во время каждого цикла инфекции. [21]

Нелитическая экспрессия клеток насекомых [ править ]

Нелитическая экспрессия клеток насекомых является альтернативой литической системе экспрессии бакуловирусов. При нелитической экспрессии векторы временно или стабильно трансфицируются в хромосомную ДНК клеток насекомых для последующей экспрессии генов. [22] [23] Затем следует отбор и скрининг рекомбинантных клонов. [24] Нелитическая система была использована для получения более высокого выхода белка и более быстрой экспрессии рекомбинантных генов по сравнению с экспрессией инфицированных бакуловирусом клеток. [23] Клеточные линии, используемые для этой системы, включают: Sf9 , Sf21 из клеток Spodoptera frugiperda , Hi-5 из Trichoplusia ni.клетки и клетки Schneider 2 и клетки Schneider 3 из клеток Drosophila melanogaster . [22] [24] В этой системе клетки не лизируются, и можно использовать несколько режимов культивирования. [22] Кроме того, воспроизводятся циклы производства белка. [22] [23] Эта система дает однородный продукт. [23] Недостатком этой системы является необходимость дополнительной стадии скрининга для отбора жизнеспособных клонов . [24]

Экскавата [ править ]

Системы экспрессии Leishmania tarentolae (не могут инфицировать млекопитающих) обеспечивают стабильное и продолжительное производство белков с высоким выходом в химически определенных средах. Полученные белки демонстрируют полностью эукариотические посттрансляционные модификации, включая гликозилирование и образование дисульфидной связи. [ необходима цитата ]

Системы млекопитающих [ править ]

Наиболее распространенными системами экспрессии у млекопитающих являются клетки яичника китайского хомячка (СНО) и клетки эмбриональной почки человека (НЕК). [25] [26] [27]

  • Клетка яичника китайского хомячка [26]
  • Мышь миелома lymphoblstoid (например NS0 клетки) [25]
  • Полностью человек
    • Эмбриональные клетки почек человека ( НЕК-293 ) [26]
    • Эмбриональные клетки сетчатки человека (Crucell's Per.C6) [26]
    • Человеческое amniocyte клетка (гликотоп и CEVEC)

Бесклеточные системы [ править ]

Бесклеточное производство белков осуществляется in vitro с использованием очищенной РНК-полимеразы, рибосом, тРНК и рибонуклеотидов. Эти реагенты могут быть получены экстракцией из клеток или из клеточной системы экспрессии. Из-за низких уровней экспрессии и высокой стоимости бесклеточных систем более широко используются клеточные системы. [28]

См. Также [ править ]

  • Целлозавр , база данных клеточных линий
  • Экспрессия гена
  • Одноклеточный белок
  • Очистка белков
  • Прецизионное брожение
  • Белок клетки-хозяина
  • Список рекомбинантных белков

Ссылки [ править ]

  1. ^ Gräslund S, Nordlund P, Weigelt J, Hallberg BM, Bray J, Gileadi O, et al. (Февраль 2008 г.). «Производство и очистка белков» . Методы природы . 5 (2): 135–46. DOI : 10.1038 / nmeth.f.202 . PMC  3178102 . PMID  18235434 .
  2. ^ Baneyx F (октябрь 1999). «Экспрессия рекомбинантного белка в Escherichia coli». Текущее мнение в области биотехнологии . 10 (5): 411–21. DOI : 10.1016 / s0958-1669 (99) 00003-8 . PMID 10508629 . 
  3. ^ Cregg JM, Cereghino JL, Shi J, Хиггинс DR (сентябрь 2000). «Экспрессия рекомбинантного белка в Pichia pastoris». Молекулярная биотехнология . 16 (1): 23–52. DOI : 10.1385 / МБ: 16: 1: 23 . PMID 11098467 . S2CID 35874864 .  
  4. ^ a b Малис Н., Уишарт Дж. А., Оливер С. Г., Маккарти Дж. Э. (2011). «Производство белка в Saccharomyces cerevisiae для изучения системной биологии». Методы системной биологии . Методы в энзимологии . 500 . С. 197–212. DOI : 10.1016 / B978-0-12-385118-5.00011-6 . ISBN 9780123851185. PMID  21943899 .
  5. ^ Кость Т.А., Condreay JP, Jarvis DL (май 2005). «Бакуловирус как универсальные векторы для экспрессии белков в клетках насекомых и млекопитающих» . Природа Биотехнологии . 23 (5): 567–75. DOI : 10.1038 / nbt1095 . PMC 3610534 . PMID 15877075 .  
  6. ^ Rosser MP, Xia W, Hartsell S, M McCaman, Zhu Y, Ван S, Харви S, P Bringmann, Кобб RR (апрель 2005). «Временная трансфекция CHO-K1-S с использованием бессывороточной среды в суспензии: система быстрой экспрессии белков млекопитающих». Экспрессия и очистка белков . 40 (2): 237–43. DOI : 10.1016 / j.pep.2004.07.015 . PMID 15766864 . 
  7. ^ Lackner A, Genta K, Koppensteiner H, Herbacek I, Holzmann K, Spiegl-Kreinecker S, Berger W, Grusch M (сентябрь 2008 г.). «Бицистронный бакуловирусный вектор для временной и стабильной экспрессии белка в клетках млекопитающих». Аналитическая биохимия . 380 (1): 146–8. DOI : 10.1016 / j.ab.2008.05.020 . PMID 18541133 . 
  8. ^ a b Visser H, Joosten V, Punt PJ, Gusakov AV, Olson PT, Joosten R, et al. (Июнь 2011 г.). «Разработка зрелой грибковой технологии и производственной платформы для промышленных ферментов на основе изолята Myceliophthora thermophila, ранее известного как Chrysosporium lucknowense C1». Промышленная биотехнология . 7 (3): 214–223. DOI : 10.1089 / ind.2011.7.214 .
  9. ^ Ван, Син; Хантер, Алан К .; Мозье, Нед М. (15.06.2009). «Белки клетки-хозяина в разработке биопрепаратов: идентификация, количественное определение и оценка риска» . Биотехнология и биоинженерия . 103 (3): 446–458. DOI : 10.1002 / bit.22304 . ISSN 0006-3592 . PMID 19388135 . S2CID 22707536 .   
  10. ^ «Определение: система выражения» . Медицинский онлайн-словарь . Центр образования в области рака, Университет Ньюкасл-апон-Тайн: Cancerweb. 1997-11-13 . Проверено 10 июня 2008 .
  11. ^ "Система выражений - определение" . Биология онлайн . Biology-Online.org. 2005-10-03 . Проверено 10 июня 2008 .
  12. ^ "сверхэкспрессия" . Оксфордский живой словарь . Издательство Оксфордского университета. 2017 . Дата обращения 18 мая 2017 . Производство аномально больших количеств вещества, кодируемого определенным геном или группой генов; появление в фенотипе аномально высокой степени характера или эффекта, приписываемых определенному гену.
  13. ^ "сверхэкспресс" . Словарь терминов по раку NCI . Национальный институт рака при Национальных институтах здоровья. 2011-02-02 . Дата обращения 18 мая 2017 . сверхэкспрессия. В биологии - создание слишком большого количества копий белка или другого вещества. Избыточная экспрессия определенных белков или других веществ может играть роль в развитии рака.
  14. ^ Jeong, H; Барб, В; Ли, Швейцария; Vallenet, D; Ю, Д.С. Choi, SH; Кулу, А; Ли, ЮАР; Юн, SH; Каттолико, L; Hur, CG; Парк, HS; Сегюрен, В; Kim, SC; Ой, ТЗ; Ленский, Р. Э .; Studier, FW; Daegelen, P; Ким, JF (11 декабря 2009 г.). «Последовательности генома штаммов Escherichia coli B REL606 и BL21 (DE3)». Журнал молекулярной биологии . 394 (4): 644–52. DOI : 10.1016 / j.jmb.2009.09.052 . PMID 19786035 . 
  15. ^ Brinkrolf K, J Шредера, Pühler A, Tauch A (сентябрь 2010). «Репертуар регуляции транскрипции Corynebacterium glutamicum: реконструкция сети, контролирующей пути, участвующие в производстве лизина и глутамата». Журнал биотехнологии . 149 (3): 173–82. DOI : 10.1016 / j.jbiotec.2009.12.004 . PMID 19963020 . 
  16. ^ Дата M, ITAYA H, Matsui H, Кикучи Y (январь 2006). «Секреция фактора роста эпидермиса человека Corynebacterium glutamicum» . Письма по прикладной микробиологии . 42 (1): 66–70. DOI : 10.1111 / j.1472-765x.2005.01802.x . PMID 16411922 . 
  17. ^ Мейснера D, Vollstedt A, ван Dijl JM, Freudl R (сентябрь 2007). «Сравнительный анализ твин-аргинин (Tat) -зависимой секреции белка гетерологичного модельного белка (GFP) в трех разных грамположительных бактериях». Прикладная микробиология и биотехнология . 76 (3): 633–42. DOI : 10.1007 / s00253-007-0934-8 . PMID 17453196 . S2CID 6238466 .  
  18. ^ Реталлак DM, Jin H, L Chew (февраль 2012). «Надежное производство белка в системе экспрессии Pseudomonas fluorescens». Экспрессия и очистка белков . 81 (2): 157–65. DOI : 10.1016 / j.pep.2011.09.010 . PMID 21968453 . 
  19. ^ a b Альтманн Ф., Штаудахер Э., Уилсон И.Б., Мэрц Л. (февраль 1999 г.). «Клетки насекомых как хозяева для экспрессии рекомбинантных гликопротеинов». Glycoconjugate Journal . 16 (2): 109–23. DOI : 10,1023 / A: 1026488408951 . PMID 10612411 . S2CID 34863069 .  
  20. ^ Кость Т.А., Condreay JP (октябрь 1999). «Рекомбинантные бакуловирусы как векторы экспрессии для клеток насекомых и млекопитающих». Текущее мнение в области биотехнологии . 10 (5): 428–33. DOI : 10.1016 / S0958-1669 (99) 00005-1 . PMID 10508635 . 
  21. ^ Инь J, Ли G, Ren X, Herrler G (январь 2007). «Выберите то, что вам нужно: сравнительная оценка преимуществ и ограничений часто используемых систем экспрессии чужеродных генов». Журнал биотехнологии . 127 (3): 335–47. DOI : 10.1016 / j.jbiotec.2006.07.012 . PMID 16959350 . 
  22. ^ a b c d Дайринг, Шарлотта (2011). «Оптимизация системы экспрессии S2 дрозофилы для производства терапевтических вакцин». Журнал биопроцессинга . 10 (2): 28–35. DOI : 10,12665 / j102.dyring .
  23. ^ a b c d Olczak M, Olczak T (декабрь 2006 г.). «Сравнение различных сигнальных пептидов для секреции белка в нелитической клеточной системе насекомых». Аналитическая биохимия . 359 (1): 45–53. DOI : 10.1016 / j.ab.2006.09.003 . PMID 17046707 . 
  24. ^ a b c МакКэрролл Л., Король Лос-Анджелес (октябрь 1997 г.). «Стабильные культуры клеток насекомых для производства рекомбинантных белков». Текущее мнение в области биотехнологии . 8 (5): 590–4. DOI : 10.1016 / s0958-1669 (97) 80034-1 . PMID 9353223 . 
  25. ^ а б Чжу Дж (2012-09-01). «Экспрессия белков клеток млекопитающих для биофармацевтического производства». Достижения биотехнологии . 30 (5): 1158–70. DOI : 10.1016 / j.biotechadv.2011.08.022 . PMID 21968146 . 
  26. ^ a b c d Almo SC, Love JD (июнь 2014 г.). «Лучше и быстрее: улучшения и оптимизация производства рекомбинантных белков млекопитающих» . Текущее мнение в структурной биологии . Новые конструкции и экспрессия белков / Последовательности и топология. 26 : 39–43. DOI : 10.1016 / j.sbi.2014.03.006 . PMC 4766836 . PMID 24721463 .  
  27. ↑ Hacker DL, Balasubramanian S (июнь 2016 г.). «Продукция рекомбинантного белка из стабильных линий и пулов клеток млекопитающих». Текущее мнение в структурной биологии . Новые конструкции и экспрессия белков • Последовательности и топология. 38 : 129–36. DOI : 10.1016 / j.sbi.2016.06.005 . PMID 27322762 . 
  28. ^ Розенблюм G, Куперман BS (январь 2014). «Двигатель из шасси: бесклеточный синтез белка и его применение» . Письма FEBS . 588 (2): 261–8. DOI : 10.1016 / j.febslet.2013.10.016 . PMC 4133780 . PMID 24161673 .  

Дальнейшее чтение [ править ]

  • Хиггинс С.Дж., Хеймс Б.Д. (1999). Экспрессия белка: практический подход . Издательство Оксфордского университета. ISBN 978-0-19-963623-5.
  • Банейкс, Франсуа (2004). Технологии экспрессии белков: текущее состояние и будущие тенденции . Наука о гирляндах. ISBN 978-0-9545232-5-1.

Внешние ссылки [ править ]

Ресурсы библиотеки о
производстве протеина
  • Ресурсы в вашей библиотеке
  • Ресурсы в других библиотеках