Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Бесклеточный синтез белка , также известный как синтез белка in vitro или CFPS , представляет собой производство белка с использованием биологического оборудования в бесклеточной системе , то есть без использования живых клеток . Среда для синтеза белка in vitro не ограничивается клеточной стенкой или условиями гомеостаза, необходимыми для поддержания жизнеспособности клеток. [1] Таким образом, CFPS обеспечивает прямой доступ и контроль над переводом.среда, которая является выгодной для ряда применений, включая совместную трансляционную солюбилизацию мембранных белков, оптимизацию продукции белка, включение неприродных аминокислот, селективное и сайт-специфическое мечение. [2] [3] Из-за открытой природы системы можно проверять различные условия экспрессии, такие как pH, окислительно-восстановительные потенциалы , температуры и шапероны . Поскольку нет необходимости поддерживать жизнеспособность клеток, могут производиться токсичные белки.

Введение [ править ]

Общие компоненты бесклеточной реакции включают клеточный экстракт, источник энергии, запас аминокислот , кофакторов, таких как магний , и ДНК с желаемыми генами . Клеточный экстракт получают путем лизирования интересующей клетки и центрифугирования клеточных стенок, генома ДНК и других остатков. Остатки представляют собой необходимый клеточный аппарат, включая рибосомы , аминоацил-тРНК-синтетазы , факторы инициации и удлинения трансляции , нуклеазы и т. Д.

В CFPS можно использовать два типа ДНК: плазмиды и матрицы линейной экспрессии (LET). Плазмиды имеют круглую форму и образуются только внутри клеток. LET могут быть сделаны намного эффективнее с помощью ПЦР , которая реплицирует ДНК намного быстрее, чем выращивание клеток в инкубаторе . Хотя LET легче и быстрее сделать, выход плазмид обычно намного выше в CFPS. Из-за этого многие исследования сегодня сосредоточены на оптимизации выходов ЛПЭ CFPS, чтобы приблизиться к выходам CFPS с плазмидами.

Источник энергии - важная часть бесклеточной реакции. Обычно для реакции в экстракт добавляют отдельную смесь, содержащую необходимый источник энергии вместе с запасом аминокислот. Обычными источниками являются пируват фосфоенола , ацетилфосфат и креатинфосфат .

Преимущества и применение [ править ]

CFPS имеет много преимуществ по сравнению с традиционным синтезом белков in vivo . В частности, бесклеточная реакция, включая приготовление экстракта, обычно занимает 1-2 дня, тогда как экспрессия белка in vivo может длиться 1-2 недели. [4] [5] [6] [7]

CFPS - открытая реакция. Отсутствие клеточной стенки позволяет напрямую управлять химической средой. Легко отбираются пробы, оптимизируются концентрации и можно отслеживать реакцию. Напротив, после того, как ДНК вставлена ​​в живые клетки, реакция не может быть доступна, пока она не закончится и клетки не будут лизированы.

Еще одно преимущество CFPS - отсутствие опасений по поводу токсичности. Некоторые желаемые белки и меченые белки токсичны для клеток при синтезе. [8] Поскольку живые клетки не используются, токсичность белкового продукта не вызывает серьезного беспокойства.

Эти преимущества позволяют использовать множество приложений. [9] [1] Основное применение CFPS - включение неприродных аминокислот в белковые структуры (см. Расширенный генетический код ). Открытость реакции идеальна для вставки модифицированных тРНК и неприродных аминокислот, необходимых для такой реакции.

Синтетическая биология имеет много других применений и имеет светлое будущее в таких областях, как эволюция белков , наномашины , цепи нуклеиновых кислот и синтез вирусоподобных частиц для вакцин и лекарственной терапии . [10] [11] [12]

Ограничения [ править ]

Одной из проблем, связанных с CFPS, является деградация ДНК эндогенными нуклеазами в клеточном экстракте. Это особенно проблематично с LET. В клетках есть эндонуклеазы , атакующие случайные участки цепей ДНК; однако гораздо более распространены экзонуклеазы, атакующие ДНК с концов. Поскольку плазмиды имеют круглую форму и не имеют конца, к которому могут прикрепляться экзонуклеазы, последние не влияют на них. Однако LET чувствительны к обоим. Из-за уязвимости LET, многие исследования сегодня сосредоточены на оптимизации выходов LET CFPS, чтобы приблизиться к выходам CFPS с использованием плазмид.

Одним из примеров этой улучшенной защиты с помощью плазмид является использование гамма-белка бактериофага лямбда . [13] Gam является ингибитором RecBCD , экзонуклеазы, обнаруженной в Escherichia coli ( E. coli ). [14] При использовании гамма-излучения выходы CFPS с LET были значительно увеличены и были сопоставимы с выходами CFPS с плазмидами. [15] Также можно приготовить экстракты PURE, что устраняет опасения, связанные с экзонуклеазами. Эти экстракты дороги в производстве и в настоящее время не являются экономичным решением проблемы экзогенной деградации ДНК.

Типы бесклеточных систем [ править ]

Обычные клеточные экстракты, используемые сегодня, сделаны из E. coli (ECE), ретикулоцитов кролика (RRL), зародышей пшеницы (WGE), клеток насекомых (ICE) и дрожжевых Kluyveromyces ( система D2P ). [1] [5] Все эти экстракты коммерчески доступны.

ЕЭК - самый популярный лизат по нескольким причинам. Это самый недорогой экстракт, и его создание требует минимальных затрат времени. Кроме того, большие количества E. coli легко выращиваются, а затем легко лизируются с помощью гомогенизатора или ультразвукового устройства . [1] ECE также обеспечивает самый высокий выход белка. Однако продукция с высоким выходом может ограничивать сложность синтезируемого белка, особенно в посттрансляционной модификации . В этом отношении могут быть предпочтительны менее эффективные эукариотические системы при условии, что в экстрактах сохраняются модифицирующие ферментные системы.

У каждой эукариотической системы есть свои преимущества и недостатки. Например, экстракт WGE дает самый высокий выход из трех экстрактов эукариот; однако он не столь эффективен для некоторых посттрансляционных модификаций, таких как гликозилирование . [5] При выборе экстракта следует учитывать тип посттрансляционной модификации, желаемый выход и стоимость.

История [ править ]

Бесклеточный синтез белка использовался более 60 лет, и, в частности, первое выяснение кодона было сделано Маршаллом Ниренбергом и Генрихом Дж. Маттеи в 1961 году в Национальном институте здравоохранения. [1] [16] Они использовали бесклеточной системы , чтобы перевести поли- урацил РНК - последовательности (или UUUUU ... в биохимических терминах) и обнаружили , что полипептид , они синтезируют состояли только аминокислота фенилаланин. Таким образом, они сделали вывод из этого полифенилаланина, что кодон UUU определяет аминокислоту фенилаланин. Расширяя эту работу, Ниренберг и его коллеги смогли определить нуклеотидный состав каждого кодона.

См. Также [ править ]

  • Эксперимент Ниренберга и Маттеи
  • Оптимизация полимеразной цепной реакции

Ссылки [ править ]

  1. ^ a b c d e Грегорио, Николь Э .; Левин, Макс З .; Оза, Джавин П. (2019). «Руководство пользователя по бесклеточному синтезу белка» . Методы и протоколы . 2 (1): 24. DOI : 10,3390 / mps2010024 .
  2. ^ Роос, C; Кай, Л; Haberstock, S; Proverbio, D; Ghoshdastider, U; Май; Филипек, S; Ван, Х; Dötsch, V; Бернхард, Ф (2014). «Высокоуровневая бесклеточная продукция мембранных белков с нанодисками». Бесклеточный синтез белка . Методы молекулярной биологии. 1118 . С. 109–30. DOI : 10.1007 / 978-1-62703-782-2_7 . ISBN 978-1-62703-781-5. PMID  24395412 .
  3. ^ Роос, C; Кай, Л; Proverbio, D; Ghoshdastider, U; Филипек, S; Dötsch, V; Бернхард, Ф (2013). «Ко-трансляционная ассоциация внеклеточных экспрессируемых мембранных белков с поставляемыми липидными бислоями». Молекулярная мембранная биология . 30 (1): 75–89. DOI : 10.3109 / 09687688.2012.693212 . PMID 22716775 . 
  4. ^ Ма Да, Ghoshdastider U, Ван Дж, Е. Вт, Dötsch В, Filipek S, Бернхард F, Ван Х (2012). «Бесклеточная экспрессия человеческой глюкозамин 6-фосфат N-ацетилтрансферазы (HsGNA1) для скрининга ингибиторов». Protein Expr. Purif . 86 (2): 120–6. DOI : 10.1016 / j.pep.2012.09.011 . PMID 23036358 . 
  5. ^ a b c Карлсон Э.Д., Ган Р., Ходжман К.Э., Джеветт М.С. (2012). «Бесклеточный синтез белка: приложения достигли совершеннолетия» . Biotechnol. Adv . 30 (5): 1185–94. DOI : 10.1016 / j.biotechadv.2011.09.016 . PMC 4038126 . PMID 22008973 .  
  6. ^ Левин, Макс З .; Грегорио, Николь Э .; Джеветт, Майкл С.; Уоттс, Кэтрин Р .; Оза, Джавин П. (25 февраля 2019 г.). «Бесклеточный синтез белка на основе Escherichia coli: протоколы для надежной, гибкой и доступной платформенной технологии» . Журнал визуализированных экспериментов (144). DOI : 10.3791 / 58882 . ISSN 1940-087X . 
  7. ^ https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fbioe.2020.00941/
  8. ^ Джексон AM (2004). «Бесклеточный синтез белка для протеомики» . Брифинги по функциональной геномике и протеомике . 2 (4): 308–319. DOI : 10.1093 / bfgp / 2.4.308 . ISSN 1473-9550 . 
  9. ^ https://cellfreesystems.org/
  10. ^ Банди, Брэдли С.; Franciszkowicz, Marc J .; Шварц, Джеймс Р. (2008). «Бесклеточный синтез вирусоподобных частиц на основе Escherichia coli». Биотехнология и биоинженерия . 100 (1): 28–37. DOI : 10.1002 / bit.21716 . PMID 18023052 . 
  11. ^ Patriarchi Т, Шен А, он Вт, Baikoghli М, Ченг RH, Сян Ю.К., Колман М.А., Тянь L (2018). «Нанодоставка функционального мембранного рецептора для управления клеточным фенотипом» . Sci. Rep . 8 (1): 3556. Bibcode : 2018NatSR ... 8.3556P . DOI : 10.1038 / s41598-018-21863-3 . PMC 5824837 . PMID 29476125 .  
  12. ^ Тинафар, Эйдан; Хаэнес, Катарина; Парди, Кейт (8 августа 2019 г.). «Синтетическая биология становится бесклеточной» . BMC Biology . 17 (1). DOI : 10.1186 / s12915-019-0685-х .
  13. ^ «gam - белок-ингибитор нуклеазы хозяина гамма - фаг Escherichia lambda - ген и белок гамма» . www.uniprot.org . Проверено 20 октября 2017 .
  14. ^ Мерфи, Кенан С. (2007). «Gam-белок ингибирует связывание RecBCD с концами дцДНК». Журнал молекулярной биологии . 371 (1): 19–24. DOI : 10.1016 / j.jmb.2007.05.085 . PMID 17583735 . 
  15. ^ Ситараман, Калавати; Эспозито, Доминик; Кларманн, Джордж; Грайс, Стюарт Ф. Ле; Хартли, Джеймс Л; Чаттерджи, Деб К. (2004). «Новая система бесклеточного синтеза белка». Журнал биотехнологии . 110 (3): 257–263. DOI : 10.1016 / j.jbiotec.2004.02.014 . PMID 15163516 . 
  16. ^ Ниренберг, МВт; Matthaei, JH (1961). «Зависимость внеклеточного синтеза белка в E. Coli от природных или синтетических полирибонуклеотидов» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 47 (10): 1588–1602. Bibcode : 1961PNAS ... 47.1588N . DOI : 10.1073 / pnas.47.10.1588 . PMC 223178 . PMID 14479932 .  
  • Спирин, А .; Баранов, В .; Рябова, Л .; Оводов, С .; Алахов Ю. (1988). «Система непрерывной бесклеточной трансляции, способная производить полипептиды с высоким выходом». Наука . 242 (4882): 1162–4. Bibcode : 1988Sci ... 242.1162S . DOI : 10.1126 / science.3055301 . PMID  3055301 .

Дальнейшее чтение [ править ]

  • Hartsough EM, Shah P, Larsen AC, Chaput JC (сентябрь 2015 г.). «Сравнительный анализ бесклеточных экспрессионных систем эукариот» . Биотехнологии . 59 (3): 149–51. DOI : 10.2144 / 000114327 . PMID  26345507 .