Нуклеазы (также архаический известная как nucleodepolymerase или polynucleotidase ) представляет собой фермент , способный расщеплять фосфодиэфирные связи между нуклеотидами из нуклеиновых кислот . Нуклеазы по- разному влияет одиночный и двойной многожильных перерывы в их молекул - мишеней. В живых организмах они являются важным механизмом для многих аспектов восстановления ДНК . Дефекты некоторых нуклеаз могут вызвать генетическую нестабильность или иммунодефицит . [1] Нуклеазы также широко используются вмолекулярное клонирование . [2]
Есть две основные классификации, основанные на локусе активности. Экзонуклеазы переваривают нуклеиновые кислоты с концов. Эндонуклеазы действуют на участки в середине молекул-мишеней. Далее они подразделяются на дезоксирибонуклеазы и рибонуклеазы . Первый действует на ДНК , второй - на РНК . [2]
История
В конце 1960-х ученые Стюарт Линн и Вернер Арбер выделили примеры двух типов ферментов, ответственных за ограничение роста фагов у бактерий Escherichia coli ( E. coli ). [3] [4] Один из этих ферментов добавил к ДНК метильную группу , образуя метилированную ДНК , в то время как другой расщепил неметилированную ДНК в самых разных местах по длине молекулы. Первый тип фермента был назван « метилазой », а второй - « рестрикционной нуклеазой ». Эти ферментные инструменты были важны для ученых, которые собирали инструменты, необходимые для « вырезания и вставки » молекул ДНК. Тогда был нужен инструмент, который бы разрезал ДНК в определенных местах, а не в случайных местах по длине молекулы, чтобы ученые могли разрезать молекулы ДНК предсказуемым и воспроизводимым способом.
Важное событие произошло, когда ХО Смит, К. Уилкокс и Т. Дж. Келли, работая в Университете Джона Хопкинса в 1968 году, выделили и охарактеризовали первую рестрикционную нуклеазу , функционирование которой зависело от конкретной нуклеотидной последовательности ДНК . Работая с бактериями Haemophilus influenzae , эта группа выделила фермент под названием Hind II , который всегда разрезает молекулы ДНК в определенной точке в определенной последовательности из шести пар оснований. Они обнаружили, что фермент Hind II всегда разрезает непосредственно в центре этой последовательности (между 3-ей и 4-й парами оснований).
Система числовой классификации
Большинство нуклеаз классифицируются по номеру Комиссии по ферментам «Номенклатурного комитета Международного союза биохимии и молекулярной биологии » как гидролазы (номер ЕС 3). Нуклеазы принадлежат точно так же, как фосфодиэстераза , липаза и фосфатаза, к эстеразам (EC-номер 3.1), подгруппе гидролаз. Эстеразы, к которым принадлежат нуклеазы, классифицируются с номерами ЕС 3.1.11 - ЕС-номерами 3.1.31.
Состав
Первичная структура нуклеазы в целом плохо консервативна и минимально консервативна на активных сайтах, поверхности которых в основном состоят из кислотных и основных аминокислотных остатков. Нуклеазы можно разделить на складывающиеся семейства. [5]
Узнаваемость сайта
Нуклеаза должна связываться с нуклеиновой кислотой, прежде чем она сможет расщепить молекулу. Это влечет за собой определенную степень признания. Нуклеазы по-разному используют как неспецифические, так и специфические ассоциации в способах распознавания и связывания. Оба способа играют важную роль в живых организмах, особенно в репарации ДНК. [7]
Неспецифические эндонуклеазы, участвующие в репарации ДНК, могут сканировать ДНК на предмет последовательностей-мишеней или повреждений . Такая нуклеаза диффундирует по ДНК, пока не встретит мишень, после чего остатки ее активного центра взаимодействуют с химическими группами ДНК. В случае эндонуклеаз, таких как EcoRV , BamHI и PvuII, это неспецифическое связывание включает электростатические взаимодействия между минимальной площадью поверхности белка и ДНК. Эта слабая ассоциация оставляет общую форму ДНК недеформированной, оставаясь в B-форме . [7]
В отличие от этого, сайт-специфическая нуклеаза образует гораздо более сильные ассоциации. Он втягивает ДНК в глубокую бороздку своего ДНК-связывающего домена . Это приводит к значительной деформации третичной структуры ДНК и достигается с помощью поверхностей, богатых основными (положительно заряженными) остатками. Он участвует в обширном электростатическом взаимодействии с ДНК. [7]
Некоторые нуклеазы, участвующие в репарации ДНК, проявляют частичную последовательность-специфичность. однако большинство из них являются неспецифическими, вместо этого распознавая структурные аномалии, возникающие в основной цепи ДНК из- за несовпадения пар оснований . [7]
Структурно-специфическая нуклеаза
Подробнее см. Эндонуклеаза лоскута .
Последовательно-специфическая нуклеаза
Фермент | Источник | Последовательность распознавания | Резать |
---|---|---|---|
Hind II | Haemophilus influenzae | 5'-GTYRAC-3 ' | 5'– GTY RAC –3 ' |
R = A или G ; Y = C или T |
С момента открытия Hind II из более чем 230 штаммов бактерий было выделено более 900 рестрикционных ферментов, некоторые из которых специфичны для последовательности, а некоторые нет . Эти рестрикционные ферменты обычно имеют названия, которые отражают их происхождение: первая буква названия относится к роду, а вторые две буквы - к виду прокариотической клетки, из которой они были выделены. Например, Eco RI происходит от бактерии Escherichia coli RY13, а HindII происходит от штамма Haemophilus influenzae Rd. Цифры, следующие за названиями нуклеаз, указывают порядок, в котором ферменты были выделены из отдельных штаммов бактерий: Eco RI , Eco RII .
Эндонуклеазы
Эндонуклеаза рестрикции функционирует, «сканируя» длину молекулы ДНК. Как только он встречает свою конкретную последовательность распознавания, он связывается с молекулой ДНК и делает по одному разрезу в каждой из двух сахарно-фосфатных цепей. Положения этих двух разрезов как по отношению друг к другу, так и по отношению к самой последовательности распознавания определяются идентичностью эндонуклеазы рестрикции. Различные эндонуклеазы дают разные наборы разрезов, но одна эндонуклеаза всегда будет разрезать определенную последовательность оснований одинаково, независимо от того, на какую молекулу ДНК она действует. После того, как надрезы будут сделаны, молекула ДНК разобьется на фрагменты.
Порезка в шахматном порядке
Не все эндонуклеазы рестрикции разрезают симметрично и оставляют тупые концы, как у Hind II, описанного выше. Многие эндонуклеазы расщепляют скелеты ДНК в положениях, которые не находятся прямо напротив друг друга, создавая выступы. Например, нуклеаза Eco RI имеет последовательность узнавания 5'—GAATTC—3'
.
Фермент | Источник | Последовательность распознавания | Резать |
---|---|---|---|
Hind III | Haemophilus influenzae | 3'-TTCGAA-5' | 3'– TTCGA A –5' |
Eco RI | кишечная палочка | 3'-CTTAAG-5' | 3'– CTTAA G –5' |
Бам привет | Bacillus amyloliquefaciens | 3'-CCTAGG-5' | 3'– CCTAG G –5' |
Когда фермент встречает эту последовательность, он расщепляет каждую цепь между G и ближайшими остатками основания A. После того, как разрезы сделаны, полученные фрагменты удерживаются вместе только относительно слабыми водородными связями, которые удерживают дополнительные основания друг к другу. Слабость этих связей позволяет фрагментам ДНК отделяться друг от друга. Каждый полученный фрагмент имеет выступающий 5 'конец, состоящий из непарных оснований. Другие ферменты создают разрезы в основной цепи ДНК, что приводит к выступающим 3 'концам. Выступающие концы - 3 'и 5' - иногда называют « липкими концами », потому что они имеют тенденцию связываться с комплементарными последовательностями оснований. Другими словами, если непарная длина оснований 5'—AATT—3'
встречает другую неспаренную длину с последовательностью, 3'—TTAA—5'
они будут связываться друг с другом - они «липкие» друг для друга. Затем фермент лигаза используется для соединения фосфатных скелетов двух молекул. Клеточное или даже видовое происхождение липких концов не влияет на их липкость. Любая пара комплементарных последовательностей будет иметь тенденцию связываться, даже если одна из последовательностей происходит от длины человеческой ДНК, а другая - от длины бактериальной ДНК. Фактически, именно это качество липкости позволяет производить молекулы рекомбинантной ДНК, молекулы, которые состоят из ДНК из разных источников, и которые положили начало технологии генной инженерии .
Роль в природе
Ремонт ДНК
Поскольку все клетки зависят от ДНК как носителя генетической информации, генетический контроль качества является важной функцией всех организмов. Репликация ДНК - это процесс, подверженный ошибкам, а сами молекулы ДНК уязвимы для модификации многими метаболическими факторами и факторами окружающей среды. Повсеместно распространенные примеры включают активные формы кислорода , ближний ультрафиолет и ионизирующее излучение . Многие нуклеазы участвуют в репарации ДНК, распознавая участки повреждения и отщепляя их от окружающей ДНК. Эти ферменты действуют независимо или в комплексах . Большинство нуклеаз, участвующих в репарации ДНК, неспецифичны для последовательности. Они распознают участки повреждения за счет деформации вторичной структуры двунитевой ДНК (дцДНК). [5]
Вычитка репликации
Во время репликации ДНК , ДНК - полимеразы удлиненных новых нити ДНК против комплементарных нитей шаблона. Большинство ДНК - полимеразы содержат две различных ферментные доменов : а полимеразы и корректуру экзонуклеазу . Полимераза удлиняет новую цепь в направлении 5 '→ 3'. Экзонуклеаза удаляет ошибочные нуклеотиды с той же цепи в направлении 3 '→ 5'. Эта экзонуклеазная активность важна для способности ДНК-полимеразы к корректуре. Делеции, инактивирующие или удаляющие эти нуклеазы, увеличивают частоту мутаций и смертность пораженных микробов и рака у мышей. [8]
Остановлена вилка репликации
Многие формы повреждения ДНК останавливают развитие репликационной вилки , в результате чего ДНК-полимеразы и связанные с ними механизмы покидают вилку. Затем он должен обрабатываться специфичными для вилки белками. Наиболее заметным является MUS81 . Делеции которых вызывают у дрожжей чувствительность к УФ-излучению или повреждению метилированием , в дополнение к мейотическим дефектам. [5]
Обработка фрагментов Окадзаки
Повсеместной задачей в клетках является удаление праймеров РНК фрагмента Окадзаки из репликации. Большинство таких праймеров вырезают из вновь синтезированной отстающей нити ДНК с помощью эндонуклеаз семейства РНКазы Н . В эукариот и архебактерий , то лоскут эндонуклеазы FEN1 также участвует в обработке фрагментов Okazaki. [5]
Исправление несоответствия
Восстановление несоответствия ДНК в любом данном организме осуществляется набором специфичных для несоответствия эндонуклеаз. У прокариот эту роль в первую очередь выполняют MutSLH и белки, связанные с репарацией очень коротких участков (VSP repair).
Система MutSLH (включающая MutS , MutL и MutH) исправляет точечные мутации и небольшие повороты . MutS распознает несоответствия и связывается с ними, где рекрутирует MutL и MutH. MutL опосредует взаимодействие между MutS и MutH и усиливает эндонуклеазную активность последнего. MutH распознает гемиметилированные 5'—GATC—3'
сайты и расщепляется рядом с G
неметилированной цепью (недавно синтезированной цепью).
Восстановление VSP инициируется эндонуклеазой Vsr. Он исправляет определенное T/G
несоответствие , вызванное спонтанным дезаминированием из метилированного цитозина в тимины. Vsr распознает последовательность , где он надрезает цепь ДНК на 5'-стороне несовпадающего тимина (подчеркнуто в предыдущей последовательности). Одна из экзонуклеаз RecJ, ExoVII или ExoI затем разрушает сайт до того, как ДНК-полимераза повторно синтезирует разрыв в цепи. [5]5'—CTWGG—3'
Базовая эксцизионная пластика
Образование AP-сайта - обычное явление в дцДНК. Это результат спонтанного гидролиза и активности ДНК-гликозилаз в качестве промежуточного шага в эксцизионной репарации оснований . Эти AP-сайты удаляются AP-эндонуклеазами , которые вызывают разрывы одиночных цепей вокруг сайта. [5]
Эксцизионная репарация нуклеотидов
Эксцизионная репарация нуклеотидов , не путать с эксцизионной репарацией оснований, включает удаление и замену поврежденных нуклеотидов. Примеры сшивки , аддуктов и повреждений (вызванных ультрафиолетовым светом или активными формами кислорода ) могут запускать этот путь восстановления. Короткие участки одноцепочечной ДНК, содержащие такой поврежденный нуклеотид, удаляются из дуплексной ДНК отдельными эндонуклеазами, воздействующими на разрывы выше и ниже повреждения. Делеции или мутации, влияющие на эти нуклеазы, вызывают повышенную чувствительность к ультрафиолетовому повреждению и канцерогенезу. Такие аномалии могут даже препятствовать развитию нервной системы.
У бактерий оба разреза выполнены комплексом UvrB-UvrC . У почкующихся дрожжей Rad2 и комплекс Rad1-Rad10 делают 5 'и 3' разрезы соответственно. У млекопитающих, гомологи XPG и XPF - ERCC1 влияют одни и те же соответствующие ники. [9]
Ремонт двухниточного разрыва
В клетках регулярно происходят двухцепочечные разрывы , как преднамеренные, так и непреднамеренные. Непреднамеренные разрывы обычно вызываются ионизирующим излучением , различными экзогенными и эндогенными химическими агентами и вилками остановки репликации. Преднамеренные разрывы образуются как посредники в мейозе и рекомбинации V (D) J , которые в первую очередь репарируются посредством гомологичной рекомбинации и негомологичного соединения концов . В обоих случаях требуется, чтобы концы в двухцепочечных разрывах были обработаны нуклеазами, прежде чем может произойти восстановление. Одна из таких нуклеаз представляет собой комплекс Mre11 с Rad50 . Мутации Mre11 могут вызывать расстройство, подобное атаксии-телеангиэктазии . [9]
V (D) J-рекомбинация включает раскрытие структур « стебель-петля», связанных с двухцепочечными разрывами, и последующее соединение обоих концов. В этой реакции участвует комплекс Artemis-DNAPK cs . Хотя Artemis проявляет экзонуклеазную активность 5 '→ 3' оцДНК, когда она одна, ее образование в комплексе с ДНК-PK cs делает возможным эндонуклеазный процессинг стволовых петель. Дефекты любого из белков вызывают тяжелый иммунодефицит. [9]
С другой стороны, гомологичная рекомбинация включает два гомологичных дуплекса ДНК, соединенных D-петлями или соединениями Холлидея . У бактерий, эндонуклеазы , как RuvC Resolve Holliday переходы на два отдельную dsDNAs расщепления перекрестков на два симметричных участках вблизи переход центра. У эукариот FEN1 , XPF - ERCC1 и MUS81 расщепляют D-петли, а Cce1 / Ydc2 обрабатывает соединения Холлидея в митохондриях. [9]
Мегануклеазы
Частота, с которой конкретная нуклеаза будет разрезать данную молекулу ДНК, зависит от сложности ДНК и длины последовательности распознавания нуклеазы; из-за статистической вероятности случайного нахождения оснований в определенном порядке более длинная последовательность распознавания приведет к менее частому перевариванию. Например, данная последовательность из четырех оснований (соответствующая сайту распознавания для гипотетической нуклеазы), по прогнозам, будет встречаться в среднем каждые 256 пар оснований (где 4 ^ 4 = 256), но любая заданная последовательность из шести оснований будет ожидаемой. встречаться в среднем один раз на каждые 4096 пар оснований (4 ^ 6 = 4096).
Одно уникальное семейство нуклеаз - это мегануклеазы , которые характеризуются наличием более крупных и, следовательно, менее распространенных последовательностей распознавания, состоящих из 12-40 пар оснований. Эти нуклеазы особенно полезны для применения в генной инженерии и геномной инженерии у сложных организмов, таких как растения и млекопитающие, где обычно более крупные геномы (насчитывающие миллиарды пар оснований) могут приводить к частому и вредному сайт-специфическому расщеплению с использованием традиционных нуклеаз.
Смотрите также
- HindIII
- Лигаза
- Микрококковая нуклеаза
- Анализ защиты от нуклеаз
- Нуклеаза P1
- PIN-домен
- Полимераза
- Нуклеаза S1
Рекомендации
- ^ Нисино T, Морикава K (декабрь 2002). «Структура и функция нуклеаз в репарации ДНК: форма, захват и лезвие ножниц ДНК» . Онкоген . 21 (58): 9022–32. DOI : 10.1038 / sj.onc.1206135 . PMID 12483517 .
- ^ а б Rittié L, Perbal B (июнь 2008 г.). «Ферменты, используемые в молекулярной биологии: полезное руководство» . Журнал сотовой связи и сигнализации . 2 (1–2): 25–45. DOI : 10.1007 / s12079-008-0026-2 . PMC 2570007 . PMID 18766469 .
- ^ Линн С., Арбер В. (апрель 1968 г.). «Хозяин-специфичность ДНК, продуцируемой Escherichia coli, X. Ограничение репликативной формы fd фага in vitro» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 59 (4): 1300–6. DOI : 10.1073 / pnas.59.4.1300 . PMC 224867 . PMID 4870862 .
- ^ Арбер В., Линн С. (1969). «Модификация и рестрикция ДНК». Ежегодный обзор биохимии . 38 : 467–500. DOI : 10.1146 / annurev.bi.38.070169.002343 . PMID 4897066 .
- ^ а б в г д е Нишино Т., Морикава К. (декабрь 2002 г.). «Структура и функция нуклеаз в репарации ДНК: форма, захват и лезвие ножниц ДНК» . Онкоген . 21 (58): 9022–32. DOI : 10.1038 / sj.onc.1206135 . PMID 12483517 .
- ^ Винклер Ф.К., Баннер Д.В., Офнер С., Церноглоу Д., Браун Р.С., Хитман С.П. и др. (Май 1993 г.). «Кристаллическая структура эндонуклеазы EcoRV и ее комплексов с родственными и неродственными фрагментами ДНК» . Журнал EMBO . 12 (5): 1781–95. DOI : 10,2210 / pdb4rve / PDB . PMC 413397 . PMID 8491171 .
- ^ а б в г Нишино Т., Морикава К. (декабрь 2002 г.). «Структура и функция нуклеаз в репарации ДНК: форма, захват и лезвие ножниц ДНК» . Онкоген . 21 (58): 9022–32. DOI : 10.1038 / sj.onc.1206135 . PMID 12483517 .
- ^ Нишино Т., Морикава К. (декабрь 2002 г.). «Структура и функция нуклеаз в репарации ДНК: форма, захват и лезвие ножниц ДНК» . Онкоген . 21 (58): 9022–32. DOI : 10.1038 / sj.onc.1206135 . PMID 12483517 .
- ^ а б в г Нишино Т., Морикава К. (декабрь 2002 г.). «Структура и функция нуклеаз в репарации ДНК: форма, захват и лезвие ножниц ДНК» . Онкоген . 21 (58): 9022–32. DOI : 10.1038 / sj.onc.1206135 . PMID 12483517 .
Внешние ссылки
- Таблица примеров рестрикционных ферментов
- Ограничение ферментативного действия EcoRI
- Словарь энзимов
- Нуклеазы (Основной источник страницы ...)