Секвенатор ДНК - это научный инструмент, используемый для автоматизации процесса секвенирования ДНК . Принимая во внимание образец ДНК , секвенсор ДНК используется для определения порядка четырех оснований: G ( гуанин ), С ( цитозин ), А ( аденин ), Т ( тимин ). Затем это отображается в виде текстовой строки , называемой чтением. Некоторые секвенаторы ДНК также можно рассматривать как оптические инструменты, поскольку они анализируют световые сигналы, исходящие от флуорохромов, прикрепленных к нуклеотидам .
Производители | Roche , Illumina , Life Technologies , Beckman Coulter , Pacific Biosciences , MGI / BGI , Oxford Nanopore Technologies |
---|
Первый автоматический секвенатор ДНК, изобретенный Ллойдом М. Смитом , был представлен Applied Biosystems в 1987 году. [1] Он использовал метод секвенирования Сэнгера , технологию, которая легла в основу «первого поколения» секвенаторов ДНК [2] [ 3] и позволили завершить проект генома человека в 2001 году. [4] Это первое поколение секвенаторов ДНК по сути является автоматизированными системами электрофореза , которые обнаруживают миграцию меченых фрагментов ДНК. Следовательно, эти секвенаторы также можно использовать при генотипировании генетических маркеров, когда необходимо определять только длину фрагмента (ов) ДНК (например, микросателлитов , AFLP ).
Проект « Геном человека» стимулировал разработку более дешевых, высокопроизводительных и более точных платформ, известных как секвенаторы нового поколения (NGS), для секвенирования генома человека . К ним относятся платформы секвенирования ДНК 454, SOLiD и Illumina . Машины секвенирования нового поколения существенно увеличили скорость секвенирования ДНК по сравнению с предыдущими методами Сэнгера. Образцы ДНК можно приготовить автоматически всего за 90 минут [5], в то время как геном человека можно секвенировать с 15-кратным охватом всего за несколько дней. [6]
Более поздние секвенаторы ДНК третьего поколения, такие как SMRT и Oxford Nanopore, измеряют добавление нуклеотидов к одной молекуле ДНК в режиме реального времени.
Из-за ограничений в технологии секвенатора ДНК эти чтения короткие по сравнению с длиной генома, поэтому чтения должны быть собраны в более длинные контиги . [7] Данные могут также содержать ошибки, вызванные ограничениями в методике секвенирования ДНК или ошибками во время амплификации ПЦР . Производители секвенаторов ДНК используют ряд различных методов для определения присутствующих оснований ДНК. Конкретные протоколы, применяемые на разных платформах секвенирования, влияют на генерируемые окончательные данные. Поэтому сравнение качества и стоимости данных по разным технологиям может оказаться непростой задачей. Каждый производитель предоставляет свои собственные способы информирования об ошибках секвенирования и баллах. Однако ошибки и оценки между разными платформами не всегда можно напрямую сравнивать. Поскольку в этих системах используются различные подходы к секвенированию ДНК, выбор лучшего секвенатора и метода ДНК обычно зависит от целей эксперимента и доступного бюджета. [2]
История
Первые методы секвенирования ДНК были разработаны Гилбертом (1973) [8] и Сэнгером (1975). [9] Гилберт представил метод секвенирования, основанный на химической модификации ДНК с последующим расщеплением по определенным основаниям, тогда как метод Сэнгера основан на терминации дидезоксинуклеотидной цепи. Метод Сэнгера стал популярным благодаря своей повышенной эффективности и низкой радиоактивности. Первым автоматическим секвенатором ДНК был AB370A, представленный в 1986 году компанией Applied Biosystems . AB370A был способен секвенировать 96 образцов одновременно, 500 килобаз в день и достигая длины считывания до 600 оснований. Это было началом «первого поколения» секвенаторов ДНК [2] [3], в которых реализовано секвенирование по Сэнгеру, флуоресцентные дидезоксинуклеотиды и полиакриламидный гель, помещенный между стеклянными пластинами - пластинчатыми гелями. Следующим крупным достижением стал выпуск в 1995 году AB310, в котором для разделения цепей ДНК с помощью электрофореза использовался линейный полимер в капилляре вместо пластинчатого геля. Эти методы легли в основу завершения проекта генома человека в 2001 году. [4] Проект генома человека стимулировал разработку более дешевых, высокопроизводительных и более точных платформ, известных как секвенсоры нового поколения (NGS). В 2005 году компания 454 Life Sciences выпустила секвенатор 454, за которым последовали анализатор генома Solexa и SOLiD (поддерживаемое обнаружение лигирования олиго) от Agencourt в 2006 году. Applied Biosystems приобрела Agencourt в 2006 году, а в 2007 году Roche купила 454 Life Sciences, а Illumina приобрела Solexa . Ion Torrent вышел на рынок в 2010 году и был приобретен компанией Life Technologies (ныне Thermo Fisher Scientific). И BGI начала производство секвенсоров в Китае после приобретения Complete Genomics под своим крылом MGI . Это все еще самые распространенные системы NGS из-за их конкурентоспособной стоимости, точности и производительности.
Совсем недавно было представлено третье поколение секвенаторов ДНК. Методы секвенирования, применяемые этими секвенаторами, не требуют амплификации ДНК (полимеразная цепная реакция - ПЦР), что ускоряет подготовку образца перед секвенированием и снижает количество ошибок. Кроме того, данные секвенирования собираются из реакций, вызванных добавлением нуклеотидов в комплементарной цепи в режиме реального времени. Две компании представили разные подходы в своих секвенсорах третьего поколения. Секвенсоры Pacific Biosciences используют метод, называемый одномолекулярным в реальном времени (SMRT), где данные секвенирования производятся с помощью света (захваченного камерой), излучаемого при добавлении нуклеотида к комплементарной цепи ферментами, содержащими флуоресцентные красители. Oxford Nanopore Technologies - еще одна компания, разрабатывающая секвенаторы третьего поколения с использованием электронных систем, основанных на технологиях обнаружения нанопор.
Производители секвенаторов ДНК
Секвенсоры ДНК были разработаны, изготовлены и проданы, в частности, следующими компаниями.
Рош
Секвенатор ДНК 454 стал первым коммерчески успешным секвенатором нового поколения. [10] Он был разработан 454 Life Sciences и приобретен компанией Roche в 2007 году. 454 использует обнаружение пирофосфата, высвобождаемого в результате реакции ДНК-полимеразы при добавлении нуклеотида к матричному штамму.
В настоящее время Roche производит две системы на основе своей технологии пиросеквенирования: GS FLX + и GS Junior System. [11] Система GS FLX + обещает длину считывания приблизительно 1000 пар оснований, в то время как система GS Junior обещает считывание 400 пар оснований. [12] [13] Предшественник GS FLX +, система 454 GS FLX Titanium была выпущена в 2008 году, обеспечивая выход 0,7 ГБ данных за цикл, с точностью 99,9% после качественного фильтра и длиной считывания до 700 бит / с. . В 2009 году компания Roche выпустила GS Junior, настольную версию секвенсора 454 с длиной считывания до 400 пар оснований и упрощенной подготовкой библиотеки и обработкой данных.
Одним из преимуществ систем 454 является их скорость работы. Человеческие ресурсы могут быть уменьшены за счет автоматизации подготовки библиотеки и полуавтоматизации эмульсионной ПЦР. Недостатком системы 454 является то, что она подвержена ошибкам при оценке количества оснований в длинной цепочке идентичных нуклеотидов. Это называется ошибкой гомополимера и возникает, когда в ряду 6 или более одинаковых оснований. [14] Еще одним недостатком является то, что цена на реагенты относительно выше по сравнению с другими секвенаторами следующего поколения.
В 2013 году компания «Рош» объявила, что прекратит разработку 454 технологий и полностью выведет из эксплуатации 454 машины в 2016 году. [15] [16]
Рош производит ряд программных инструментов, оптимизированных для анализа 454 данных секвенирования. [17] GS Run Processor [18] преобразует необработанные изображения, созданные в ходе секвенирования, в значения интенсивности. Процесс состоит из двух основных этапов: обработки изображения и обработки сигнала. Программное обеспечение также применяет нормализацию, коррекцию сигнала, базовый вызов и оценки качества для отдельных считываний. Программное обеспечение выводит данные в файлах стандартного формата блок-схемы (или SFF) для использования в приложениях анализа данных (GS De Novo Assembler, GS Reference Mapper или GS Amplicon Variant Analyzer). GS De Novo Assembler - это инструмент для сборки de novo полных геномов размером до 3 ГБ на основе одного считывания с дробовиком или в сочетании с парными конечными данными, сгенерированными 454 секвенсорами. Он также поддерживает сборку транскриптов de novo (включая анализ), а также обнаружение вариантов изоформы. [17] GS Reference Mapper сопоставляет короткие чтения с эталонным геномом, генерируя согласованную последовательность. Программное обеспечение может генерировать выходные файлы для оценки с указанием вставок, удалений и SNP. Может обрабатывать большие и сложные геномы любого размера. [17] Наконец, анализатор вариантов GS Amplicon сопоставляет показания образцов ампликона с эталоном, идентифицируя варианты (связанные или нет) и их частоту. Его также можно использовать для обнаружения неизвестных и низкочастотных вариантов. Он включает графические инструменты для анализа трасс. [17]
Иллюмина
Illumina производит ряд машин для секвенирования нового поколения с использованием технологий, приобретенных у Manteia Predictive Medicine и разработанных Solexa. [19] Illumina производит ряд секвенирующих машин следующего поколения, использующих эту технологию, включая HiSeq, Genome Analyzer IIx, MiSeq и HiScanSQ, которые также могут обрабатывать микрочипы . [20]
Технология, ведущая к этим секвенаторам ДНК, была впервые выпущена компанией Solexa в 2006 году как анализатор генома. [10] Illumina приобрела Solexa в 2007 году. Анализатор генома использует метод секвенирования путем синтеза. Первая модель производила 1 Гб за пробег. В течение 2009 года объем производства был увеличен с 20 Гбайт в августе до 50 Гбайт в декабре. В 2010 году Illumina выпустила HiSeq 2000 с выходной мощностью 200, а затем 600 Гбайт на цикл, что заняло бы 8 дней. На момент своего выпуска HiSeq 2000 предоставлял одну из самых дешевых платформ для секвенирования по цене 0,02 доллара за миллион оснований по оценке Пекинского института геномики .
В 2011 году Illumina выпустила настольный секвенсор под названием MiSeq. На момент выпуска MiSeq мог генерировать 1,5 Гб за прогон с парными чтениями в конце 150 бит / с. Цикл секвенирования может быть выполнен за 10 часов при использовании автоматической подготовки образцов ДНК. [10]
Illumina HiSeq использует два программных инструмента для расчета количества и положения кластеров ДНК для оценки качества секвенирования: систему управления HiSeq и анализатор в реальном времени. Эти методы помогают оценить, мешают ли соседние скопления друг другу. [10]
Технологии Жизни
Life Technologies (теперь Thermo Fisher Scientific) производит секвенаторы ДНК под брендами Applied Biosystems и Ion Torrent . Applied Biosystems производит платформу для секвенирования нового поколения SOLiD [21] и ДНК-секвенаторы на основе Сэнгера, такие как 3500 Genetic Analyzer. [22] Под брендом Ion Torrent компания Applied Biosystems производит четыре секвенсора следующего поколения: систему Ion PGM, систему Ion Proton, систему Ion S5 и Ion S5xl. [23] Предполагается, что компания также разрабатывает свой новый секвенатор капиллярной ДНК под названием SeqStudio, который будет выпущен в начале 2018 года. [24]
SOLiD systems была приобретена Applied Biosystems в 2006 году. SOLiD применяет секвенирование путем лигирования и двухосновного кодирования . Первая система SOLiD была запущена в 2007 году и обеспечивала считывание данных длиной 35 бит и 3G за один прогон. После пяти обновлений в 2010 году была выпущена система секвенирования 5500xl, значительно увеличившая длину считывания до 85 бит / с, повышая точность до 99,99% и производя 30 ГБ за 7-дневный прогон. [10]
Ограниченная длина чтения SOLiD остается значительным недостатком [25] и в некоторой степени ограничивает его использование в экспериментах, где длина чтения менее важна, таких как повторное секвенирование и анализ транскриптома, а также в недавних экспериментах по ChIP-Seq и метилированию. [10] Время подготовки образцов ДНК для систем SOLiD стало намного быстрее благодаря автоматизации подготовки библиотек для секвенирования, такой как система Tecan. [10]
Данные цветового пространства, созданные платформой SOLiD, могут быть декодированы в основы ДНК для дальнейшего анализа, однако программное обеспечение, которое учитывает исходную информацию о цветовом пространстве, может дать более точные результаты. Компания Life Technologies выпустила BioScope [26] , пакет анализа данных для повторного секвенирования, ChiP -Seq и анализа транскриптома. Он использует алгоритм MaxMapper для сопоставления считываемых значений цветового пространства.
Бекман Коултер
Beckman Coulter (ныне Danaher ) ранее производила секвенаторы ДНК на основе терминации цепи и капиллярного электрофореза под названием CEQ, включая CEQ 8000. В настоящее время компания производит систему генетического анализа GeXP, в которой используется секвенирование терминатора красителя . Этот метод использует термоциклер почти так же, как ПЦР, для денатурирования, отжига и удлинения фрагментов ДНК, амплификации секвенированных фрагментов. [27] [28]
Тихоокеанские биологические науки
Pacific Biosciences производит системы секвенирования PacBio RS и Sequel, используя метод секвенирования одной молекулы в реальном времени или SMRT. [29] Эта система может производить считывание длиной в несколько тысяч пар оснований. Более высокие необработанные ошибки чтения исправляются либо с использованием кругового консенсуса, когда одна и та же цепочка читается снова и снова, либо с использованием оптимизированных стратегий сборки . [30] Ученые сообщили о точности 99,9999% этих стратегий. [31] Система Sequel была запущена в 2015 году с увеличенной емкостью и более низкой ценой. [32] [33]
Оксфорд Нанопор
Oxford Nanopore Technologies начала поставки ранних версий своего секвенатора MinION для секвенирования нанопор в избранные лаборатории. Устройство имеет длину четыре дюйма и питается от порта USB . MinION декодирует ДНК напрямую, поскольку молекула протягивается со скоростью 450 оснований в секунду через нанопоры, взвешенные в мембране. Изменения электрического тока показывают, какая база присутствует. Его точность составляет от 60 до 85 процентов по сравнению с 99,9 процентами в обычных машинах. Даже неточные результаты могут оказаться полезными, потому что это приводит к большой длине чтения. GridION - это немного больший секвенсор, который обрабатывает до пяти проточных ячеек MinION одновременно. PromethION - еще один (неизданный) продукт, который будет использовать до 100000 пор параллельно, что больше подходит для секвенирования большого объема. [35]
Сравнение
Текущие предложения в области технологии секвенирования ДНК показывают доминирующего игрока: Illumina (декабрь 2019 г.), за которым следуют PacBio , MGI / BGI и Oxford Nanopore .
Секвенсор | Ионный торрент PGM [5] [37] [38] | 454 GS FLX [10] | HiSeq 2000 [5] [10] | SOLiDv4 [10] | PacBio [5] [39] | Sanger 3730xl [10] |
---|---|---|---|---|---|---|
Производитель | Ион Торрент (Life Technologies) | 454 Науки о жизни (Рош) | Иллюмина | Прикладные биосистемы (Life Technologies) | Тихоокеанские биологические науки | Прикладные биосистемы (Life Technologies) |
Секвенирование химии | Ионно-полупроводниковое секвенирование | Пиросеквенирование | Последовательность за синтезом на основе полимеразы | Секвенирование на основе лигирования | Фосфосвязанные флуоресцентные нуклеотиды | Обрыв цепи дидезокси |
Подход к амплификации | Эмульсионная ПЦР | Эмульсионная ПЦР | Мостовое усиление | Эмульсионная ПЦР | Одномолекулярный; без усиления | ПЦР |
Вывод данных за прогон | 100-200 Мб | 0,7 Гб | 600 Гб | 120 Гб | 0,5 - 1,0 Гб | 1.9∼84 Кб |
Точность | 99% | 99,9% | 99,9% | 99,94% | 88,0% (> 99,9999% CCS или HGAP) | 99,999% |
Время на запуск | 2 часа | 24 часа | 3–10 дней | 7–14 дней | 2–4 часа | 20 минут - 3 часа |
Прочитать длину | 200-400 п.н. | 700 п.н. | Парный конец 100x100 п.н. | Парный конец 50x50 п.н. | 14000 п.н. ( N50 ) | 400-900 п.н. |
Стоимость за запуск | 350 долларов США | 7000 долларов США | 6000 долларов США (30x геном человека) | 4000 долларов США | 125–300 долларов США | 4 доллара США (одно чтение / реакция) |
Стоимость за Мб | 1 доллар США | 10 долларов США | 0,07 доллара США | 0,13 доллара США | 0,13–0,60 доллара США | 2400 долларов США |
Стоимость за инструмент | 80 000 долларов США | 500 000 долларов США | 690 000 долларов США | 495 000 долларов США | 695 000 долларов США | 95 000 долларов США |
Рекомендации
- ^ Кук-Диган, Роберт Маллан (1991). «Истоки проекта генома человека» . Журнал FASEB . Вашингтонский университет. 5 (1): 8–11. DOI : 10.1096 / fasebj.5.1.1991595 . PMID 1991595 . S2CID 37792736 . Проверено 20 октября 2014 года .
- ^ а б в Мецкер, ML (2005). «Новые технологии в секвенировании ДНК» . Genome Res . 15 (12): 1767–1776. DOI : 10.1101 / gr.3770505 . PMID 16339375 .
- ^ а б Хатчисон, Калифорния III. (2007). «Секвенирование ДНК: от лаборатории до постели и за ее пределами» . Nucleic Acids Res . 35 (18): 6227–6237. DOI : 10.1093 / NAR / gkm688 . PMC 2094077 . PMID 17855400 .
- ^ а б Ф. С. Коллинз; М. Морган; А. Патринос (2003). «Проект генома человека: уроки крупномасштабной биологии» . Наука . 300 (5617): 286–290. Bibcode : 2003Sci ... 300..286C . DOI : 10.1126 / science.1084564 . PMID 12690187 . S2CID 22423746 .
- ^ a b c d Майкл А. Куэйл, Мириам Смит, Пол Коупленд, Томас Д Отто, Саймон Р. Харрис, Томас Р. Коннор, Анна Бертони, Гарольд П. Свердлов и Юн Гу (2012) Рассказ о трех платформах секвенирования следующего поколения: сравнение Секвенсоры Ion Torrent, Pacific Biosciences и Illumina MiSeq . BMC Genomics.
- ^ Майкл А. Куэл; Иванка Козарева; Фрэнсис Смит; Эйлвин Скалли; Филип Дж. Стивенс; Ричард Дурбин; Гарольд Свердлоу; Дэниел Дж. Тернер (2008). «Усовершенствования большого центра генома в системе секвенирования Illumina» . Нат методы . 5 (12): 1005–1010. DOI : 10.1038 / nmeth.1270 . PMC 2610436 . PMID 19034268 .
- ^ Хенг Ли, Цзюэ Руан и Ричард Дурбин (2008) http://genome.cshlp.org/content/18/11/1851 Отображение коротких последовательностей ДНК, считывающих и вызывающих варианты, с использованием показателей качества картирования. Геномные исследования.
- ^ Гилберт В., Максам А. (1973). «Нуклеотидная последовательность оператора lac» . Proc Natl Acad Sci USA . 70 (12): 13581–3584. Bibcode : 1973PNAS ... 70.3581G . дои : 10.1073 / pnas.70.12.3581 . PMC 427284 . PMID 4587255 .
- ^ Сэнгер Ф., Колсон А.Р. (май 1975 г.). «Экспресс-метод определения последовательностей в ДНК путем примированного синтеза с ДНК-полимеразой». J. Mol. Биол . 94 (3): 441–8. DOI : 10.1016 / 0022-2836 (75) 90213-2 . PMID 1100841 .
- ^ Б с д е е г ч я J K Линь Лю; Иньху Ли; Силианг Ли; Ни Ху; Иминь Хэ; Рэй Понг; Данни Линь; Лихуа Лу; Мэгги Лоу (2012). «Сравнение систем секвенирования нового поколения» . Журнал биомедицины и биотехнологии . 2012 : 251364. дои : 10,1155 / 2012/251364 . PMC 3398667 . PMID 22829749 .
- ^ «Продукция: 454 Life Sciences, компания Рош» . Архивировано из оригинала на 2012-09-13 . Проверено 5 сентября 2012 .
- ^ «Продукция - GS FLX + System: 454 Life Sciences, компания Roche» . Архивировано из оригинала на 2012-09-05 . Проверено 5 сентября 2012 .
- ^ «Продукция - GS Junior System: 454 Life Sciences, компания Roche» . Архивировано из оригинала на 2012-09-13 . Проверено 5 сентября 2012 .
- ^ Мардис, Элейн Р. (1 сентября 2008 г.). «Методы секвенирования ДНК следующего поколения». Ежегодный обзор геномики и генетики человека . 9 (1): 387–402. DOI : 10.1146 / annurev.genom.9.081307.164359 . PMID 18576944 . S2CID 2484571 .
- ^ http://www.genomeweb.com/sequencing/roche-shutting-down-454-sequencing-business « Рош» закрывает бизнес по секвенированию 454
- ^ http://www.bio-itworld.com/2013/4/23/roche-shuts-down-third-generation-ngs-research-programs.html « Рош» закрывает исследовательские программы NGS третьего поколения
- ^ а б в г «Продукты - Программное обеспечение для анализа: 454 Life Science, компания Roche» . Архивировано из оригинала на 2009-02-19 . Проверено 23 октября 2013 .
- ^ Руководство по системному программному обеспечению Genome Sequencer FLX, версия 2.3
- ^ Прогресс Солекса в генах - Businessweek
- ^ Illumina Systems
- ^ СОЛИД
- ^ Секвенирование по Сэнгеру | Технологии Жизни
- ^ http://www.thermofisher.com/iontorrent Ion Torrent
- ^ «Генетический анализатор Applied Biosystems SeqStudio - США» .
- ^ Точность системы SOLiD
- ^ Программное обеспечение SOLiD BioScope | Технологии Жизни
- ^ Рай, Алекс Дж .; Каматх, Рашми М .; Джеральд, Уильям; Флейшер, Мартин (29 октября 2008 г.). «Аналитическая проверка анализатора GeXP и разработка рабочего процесса для обнаружения биомаркеров рака с использованием мультиплексированного профилирования экспрессии генов». Аналитическая и биоаналитическая химия . 393 (5): 1505–1511. DOI : 10.1007 / s00216-008-2436-7 . PMID 18958454 . S2CID 46721686 .
- ^ Beckman Coulter, Inc - Система генетического анализа GenomeLab GeXP
- ^ Pacific Biosciences: PacBio Systems
- ^ Корен, S; Schatz, MC; Валенц, ВР; Мартин, Дж; Ховард, JT; Ганапати, G; Ван, З; Раско Д.А.; Маккомби, WR; Джарвис, ЭД; Филлиппи, AM (1 июля 2012 г.). «Гибридная коррекция ошибок и сборка de novo одномолекулярного секвенирования читает» . Природа Биотехнологии . 30 (7): 693–700. DOI : 10.1038 / nbt.2280 . PMC 3707490 . PMID 22750884 .
- ^ Чин, Чен-Шань; Александр, Дэвид Х .; Маркс, Патрик; Кламмер, Аарон А .; Дрейк, Джеймс; Хайнер, Шерил; Клам, Алисия; Коупленд, Алекс; Хаддлстон, Джон; Eichler, Evan E .; Тернер, Стивен У .; Корлач, Йонас (2013). «Негибридные, готовые сборки микробного генома на основе данных секвенирования SMRT с длинным считыванием». Методы природы . 10 (6): 563–569. DOI : 10.1038 / nmeth.2474 . PMID 23644548 . S2CID 205421576 .
- ^ «Мир Био-ИТ» .
- ^ «PacBio запускает высокопроизводительную и недорогую систему секвенирования одной молекулы» .
- ^ Гаскилл, Мелисса (29 августа 2016 г.). «Первое секвенирование ДНК в космосе меняет правила игры» . НАСА . Проверено 26 октября, 2016 .
- ^ Регаладо, Антонио (17 сентября 2014 г.). «Радикально новый секвенсор ДНК наконец попал в руки исследователей» . Обзор технологий . Проверено 3 октября 2014 года .
- ^ Shendure, J .; Джи, Х. (2008). «Секвенирование ДНК нового поколения». Nat. Biotechnol . 26 (10): 1135–1145. DOI : 10.1038 / nbt1486 . PMID 18846087 . S2CID 6384349 .
- ^ Karow, J. (2010) Ion Torrent Systems Presents $ 50000 Электронный Sequencer на AGBT . В последовательности.
- ^ «Ион ПГМ - Ион Торрент» . Архивировано из оригинала на 2012-09-20 . Проверено 13 февраля 2013 .
- ^ Тихоокеанские биологические науки