Из Википедии, свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
FlAsH-EDT2
FlAsH-EDT2.svg
Имена
Другие названия
Связующее на шпильке с флуоресцеином и мышьяком; Люмио зеленый
Идентификаторы
3D модель ( JSmol )
ЧЭБИ
ЧЭМБЛ
ChemSpider
  • InChI = 1S / C24H18As2O5S4 / c27-17-7-5-15-19 (13-3-1-2-4-14 (13) 24 (29) 30) 16-6-8-18 (28) 21 ( 26-34-11-12-35-26) 23 (16) 31-22 (15) 20 (17) 25-32-9-10-33-25 / ч1-8,27H, 9-12H2, (H , 29,30)
    Ключ: KCPRYVGBEBFLIG-UHFFFAOYSA-N
  • c1ccc (c (c1) c2c3ccc (c (c3oc-4c (c (= O) ccc24) [As] 5SCCS5) [As] 6SCCS6) O) C (= O) O
  • OC (= O) C1 = C (C = CC = C1) C1 = C2C = CC (= O) C ([As] 3SCCS3) = C2OC2 = C ([As] 3SCCS3) C (O) = CC = C12
Характеристики
C 24 H 18 As 2 O 5 S 4
Молярная масса664,49  г · моль -1
ПоявлениеТвердый
Температура плавления От 169 до 172 ° C (от 336 до 342 ° F, от 442 до 445 K)
Если не указано иное, данные приведены для материалов в их стандартном состоянии (при 25 ° C [77 ° F], 100 кПа).
Ссылки на инфобоксы

FlAsH-EDT 2 представляет собой мышьякоорганическое соединение с молекулярной формулой C 24 H 18 As 2 O 5 S 4 . Его структура основана на флуоресцеиновом ядре с двумя 1,3,2-дитиарсолановыми заместителями. Он используется в биоаналитических исследованиях в качестве флуоресцентной метки для визуализации белков в живых клетках. [1] МИГАТЬ-EDT 2 представляет собой аббревиатуру фл uorescin R сек enical ч airpin связующего - е танd i t hiol и представляет собой бледно-желтое или розоватое флуорогенное твердое вещество. Она имеет полу- структурной формулу (С 2 Н 4 AsS 2 ) 2 - (С 13 Н 5 O 3 ) -С 6 Н 4 СООН, представляющие заместителямисвязанные с dithiarsolane гидрокси ксантон ядра, присоединенные к о -замещенных молекулах из бензойной кислоты .

Flash-EDT 2 используется для конкретного сайта-маркировки, селективно связываться с белками , содержащими тетра цистеина (ТС) мотив Cys-Cys-Xxx-Xxx-Cys-Cys , и став флуоресцентный при связывании. Он проявляет неспецифическое связывание с эндогенными белками, богатыми цистеином, что означает, что он связывается с сайтами, отличными от интересующего (CCXXCC). Дальнейшая оптимизация мотива TC выявила улучшенную аффинность связывания FlAsH с мотивом CCPGCC [2] и более высокий квантовый выход, когда мотив тетрацистеина фланкирован специфическими остатками (HRWCCPGCCKTF или FLNCCPGCCMEP). [3]

Подготовка [ править ]

Шаг 1 : HgO в TFA ; Стадия 2 : AsCl 3 , затем Pd (OAc) 2 и DIEA ; Этап 3 : H 2 EDT в водном ацетоне.

FlAsH-EDT 2 можно получить в три этапа из флуоресцеина (см. Рисунок). [1]

Образование аддукта FlAsH-TC [ править ]

Многие исследования показывают, что соединения трехвалентного мышьяка связываются с парами остатков цистеина. Это связывание отвечает за токсичность многих соединений мышьяка. [4] Связывание реверсируется 1,2-этандитиолом, который прочно связывается с соединениями мышьяка, о чем свидетельствует стабильность FlAsH-EDT 2 . [5] Такую прочную связь серы и мышьяка можно, опять же, регулировать путем создания пептидного домена, который проявляет более высокое сродство к мышьяку, такого как тетрацистеиновый мотив. Путем модуляции расстояния между двумя парами остатков цистеина и пространства между центрами мышьяка FlAsH-EDT 2 может быть достигнута кооперативная и энтропийно предпочтительная связь дитиол- мышьяка. [6]

Образование аддукта FlAsH-TC

Таким образом, связывание FlAsH-EDT 2 подлежит уравновешиванию. Образование аддукта FlAsH-пептид может быть благоприятным при низкой концентрации EDT (ниже 10  мкМ ) и обратным при высокой концентрации EDT (выше 1 мМ). [6]

Свойства [ править ]

FlAsH становится флуоресцентным при связывании тетрацистеинового мотива. Он возбуждается на длине волны 508 нм и излучает 528 нм, зелено-желтый цвет свободного флуоресцеина. Квантовый выход составляет 0,49 на 250 нМ МИГАТЬ привязан к модели tetracysteine-содержащего пептида в солевом растворе с фосфатным буфером при рН 7,4. [6]

Как правило, FlAsH-EDT 2 имеет квантовую эффективность флуоресценции 0,1-0,6 с пределами обнаружения в несколько мкМ для диффузной цитозольной метки и коэффициентами экстинкции 30-80 л ммоль -1  см -1 . Комплекс FlAsH-пептид также продемонстрировал резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET) от флуоресцентных белков, таких как усиленный голубой флуоресцентный белок (ECFP) зеленого флуоресцентного белка (GFP). [7]

Заявление [ править ]

FlAsH-EDT 2 обеспечивает менее токсичное и более специфичное флуоресцентное мечение, проницаемое для мембран. [8] Модификация флуоресцеиновой составляющей также позволяет проводить многоцветный анализ. [9] Было доказано, что это хорошая альтернатива зеленым флуоресцентным белкам (GFP) с тем преимуществом, что FlAsH-EDT 2 намного меньше ( молярная масса  <1  кДа ) по сравнению с GFP (~ 30 кДа), поэтому минимизирует нарушение активности исследуемого белка. [1] [10]

Используйте [ редактировать ]

В прошлом FlAsH-EDT 2 широко использовался для изучения ряда клеточных событий in vivo и субклеточных структур в клетках животных, матричного белка вируса Эбола и неправильного связывания белков. С помощью электронной микроскопии FlAsH-EDT 2 также используется для изучения процессов транспортировки белков in situ . [11] Совсем недавно он был использован в расширенном исследовании растительных клеток, таких как арабидопсис и табак. [12]

Ссылки [ править ]

  1. ^ a b c Адамс, Стивен Р .; Цзянь, Роджер Ю. (2008). «Приготовление проницаемых через мембрану биомышьяка FlAsH-EDT 2 и ReAsH-EDT 2 для флуоресцентного мечения белков, меченных тетрацистеином» . Nat. Protoc. 3 (9): 1527–1534. DOI : 10.1038 / nprot.2008.144 . PMC  2843588 . PMID  18772880 .
  2. ^ Адамс, Стивен Р .; Кэмпбелл, Роберт Э .; Гросс, Ларри А.; Мартин, Брент Р .; Уолкап, Грант К .; Яо, Юн; Ллопис, Хуан; Цзянь, Роджер Ю. (2002). «Новые биомышьяковые лиганды и тетрацистеиновые мотивы для мечения белков in vitro и in vivo: синтез и биологические применения». Журнал Американского химического общества . 124 (21): 6063–6076. DOI : 10.1021 / ja017687n .
  3. ^ Мартин, Брент Р .; Гипманс, Бен Н.Г.; Адамс, Стивен Р .; Цзянь, Роджер Ю. (2005). «Оптимизация на основе клеток млекопитающих мотива тетрацистеина, связывающегося с биомышьяком, для улучшения флуоресценции и аффинности». Природа Биотехнологии . 23 (10): 1308. DOI : 10.1038 / nbt1136 .
  4. ^ Калеф, Эдна; Гитлер, Карлос (1994). «Очистка вицинальных дитиолсодержащих белков с помощью аффинной хроматографии на основе мышьяка». В Sies, Гельмут (ред.). Кислородные радикалы в биологических системах, часть С . Методы в энзимологии . 233 . Академическая пресса . С. 395–403. DOI : 10.1016 / S0076-6879 (94) 33046-8 . ISBN 9780080883465.
  5. ^ Уиттакер, Виктор П. (1947). «Экспериментальное исследование« кольцевой гипотезы »токсичности мышьяка» . Биохим. J. 41 (1): 56–62. DOI : 10.1042 / bj0410056 . PMC 1258423 . PMID 16748119 .   
  6. ^ a b c Гриффин, Б. Альберт; Адамс, Стивен Р .; Цзянь, Роджер Ю. (1998). «Специфическое ковалентное маркирование рекомбинантных белковых молекул внутри живых клеток». Наука . 281 (5374): 269–272. Bibcode : 1998Sci ... 281..269G . DOI : 10.1126 / science.281.5374.269 . PMID 9657724 . 
  7. ^ Адамс, Стивен Р .; Кэмпбелл, Роберт Э .; Гросс, Ларри А.; Мартин, Брент Р .; Уолкап, Грант К .; Яо, Юн; Ллопис, Хуан; Цзянь, Роджер Ю. (2002). «Новые биомышьяковые лиганды и тетрацистеиновые мотивы для маркировки белков in vitro и in vivo: синтез и биологические применения». Варенье. Chem. Soc. 124 (21): 6063–6076. DOI : 10.1021 / ja017687n .
  8. ^ Хоффманн, Карстен; Гайетта, Гвидо; Цюрн, Александр; Адамс, Стивен Р .; Терриллон, Соня; Эллисман, Марк Х .; Tsien, Roger Y .; Лозе, Мартин Дж. (2010). «Флуоресцентное мечение белков, меченных тетрацистеином, в интактных клетках» . Протоколы природы . 5 (10): 1666. DOI : 10.1038 / nprot.2010.129 . PMC 3086663 . 
  9. ^ https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/cellular-imaging/high-content-screening/flash-and-reash.html
  10. ^ Гриффин, Б. Альберт; Адамс, Стивен Р .; Джонс, Джей; Цзянь, Роджер Ю. (2000). «Флуоресцентное маркирование рекомбинантных белков в живых клетках с помощью FlAsH». В Торнере Джереми; Эмр, Скотт Д .; Абельсон, Джон Н. (ред.). Применение химерных генов и гибридных белков, часть B: клеточная биология и физиология . Методы в энзимологии . Академическая пресса . С. 565–578. DOI : 10.1016 / S0076-6879 (00) 27302-3 . ISBN 9780080496825.
  11. ^ Гайетта, Гвидо; Deerinck, Thomas J .; Адамс, Стивен Р .; Бауэр, Джеймс; Тур, Одед; Laird, Dale W .; Сосинский, Джина Е .; Цзянь, Роджер Ю .; Эллисман, Марк Х. (2002). «Многоцветная и электронно-микроскопическая визуализация торговли коннексином». Наука . 296 (5567): 503–507. Bibcode : 2002Sci ... 296..503G . DOI : 10.1126 / science.1068793 . PMID 11964472 . 
  12. ^ Estévez, Хосе М .; Сомервилль, Крис (2006). «Основанная на FlAsH флуоресцентная визуализация живых клеток синтетических пептидов, экспрессированных в Arabidopsis и табаке» . Биотехнологии . 41 (5): 569–574. DOI : 10.2144 / 000112264 .