GCaMP - это генетически кодируемый индикатор кальция (GECI), первоначально разработанный в 2001 году Джуничи Накаи. [1] Это синтетический синтез зеленого флуоресцентного белка (GFP), кальмодулина (CaM) и M13, пептидной последовательности киназы легкой цепи миозина . [2] При связывании с Ca 2+ , GCaMP флуоресцирует зеленым цветом с максимальной длиной волны возбуждения 480 нм и максимальной длиной волны излучения 510 нм. [3] Он используется в биологических исследованиях для измерения уровней внутриклеточного Ca 2+ как in vitro, так и in vivo с использованием вирусных трансфицированные или трансгенные линии клеток и животных. [2] [4] Генетическая последовательность, кодирующая GCaMP, может быть вставлена под контролем промоторов, исключительных для определенных типов клеток, обеспечивая специфическую для клеточного типа экспрессию GCaMP. [5] Поскольку Ca 2+ является вторым мессенджером, который участвует во многих клеточных механизмах и сигнальных путях , GCaMP позволяет исследователям количественно оценить активность механизмов, основанных на Ca 2+, и изучить роль ионов Ca 2+ в представляющих интерес биологических процессах.
Состав
GCaMP состоит из трех ключевых доменов: домена M13 на N-конце , домена кальмодулина (CaM) на C-конце и домена GFP в центре. Домен GFP переставлен по кругу , так что нативные N- и C-концы сливаются вместе посредством связывающей последовательности из шести аминокислот , а последовательность GFP расщепляется посередине, создавая новые N- и C-концы, которые соединяются с домены M13 и CaM. [6]
В отсутствие Ca 2+ хромофор GFP подвергается воздействию воды и существует в протонированном состоянии с минимальной интенсивностью флуоресценции. После связывания Ca 2+ домен CaM претерпевает конформационные изменения и прочно связывается с альфа-спиралью домена M13 , предотвращая доступ молекул воды к хромофору. В результате хромофор быстро депротонирует и превращается в анионную форму, которая ярко флуоресцирует, как нативный GFP. [7]
История и развитие
В 2001 году Накай и др. сообщили о разработке GCaMP1 как зонда Ca 2+ с улучшенным отношением сигнал / шум по сравнению с ранее разработанными флуоресцентными зондами Ca 2+ . [1] О первой трансгенной мыши, экспрессирующей GCaMP1, сообщалось в 2004 году. [5] Однако при 37 ˚C (физиологическая температура у млекопитающих) GCaMP1 не сворачивался стабильно и не флуоресцировал, что ограничивало его потенциальное использование в качестве индикатора кальция in vivo. [1] [8]
В 2006 году Tallini et al. впоследствии сообщили об улучшении GCaMP1 до GCaMP2, который проявлял более яркую флуоресценцию, чем GCaMP1, и большую стабильность при температурах тела млекопитающих . Tallini et al. экспрессировал GCaMP2 в кардиомиоцитах эмбрионов мышей для выполнения первого in vivo визуализации GCaMP Ca 2+ у млекопитающих. [8]
Дальнейшие модификации GCaMP, включая GCaMP3, GCaMP5, GCaMP6 и jGCaMP7, были разработаны для постепенного улучшения сигнала, чувствительности и динамического диапазона обнаружения Ca 2+ , [2] [9] [10] [11] с последними версиями демонстрируя флуоресценцию, подобную нативному GFP. [11]
Варианты использования
Как медленные варианты (GCaMP6s, jGCaMP7s), так и быстрые варианты (GCaMP6f, jGCaMP7f) используются в биологических и нейробиологических исследованиях. Медленные варианты ярче и более чувствительны к небольшим изменениям уровней Ca 2+ , таким как единичные потенциалы действия ; с другой стороны, быстрые варианты менее чувствительны, но реагируют быстрее, что делает их полезными для отслеживания изменений уровней Ca 2+ в точных временных масштабах. [12] [13] GCaMP6 также имеет вариант среды, GCaMP6m, кинетика которого является промежуточной между GCaMP6s и GCaMP6f. [12] Также используются другие варианты jGCaMP7: jGCaMP7b демонстрирует яркую базовую флуоресценцию и используется для визуализации дендритов и аксонов , в то время как jGCaMP7c демонстрирует больший контраст между максимальной и базовой флуоресценцией и полезен для визуализации больших популяций нейронов. [12]
В 2018 году Ян и др. сообщили о развитии GCaMP-X, генерируемого добавлением кальмодулин-связывающего мотива. Так как домен кальмодулина GCaMP, когда он не связан, нарушает стробирование кальциевых каналов L-типа , добавленный мотив связывания кальмодулина предотвращает вмешательство GCaMP-X в кальций-зависимые механизмы передачи сигналов. [14]
В 2020 году Zhang et al. сообщили о разработке jGCaMP8, включая чувствительные, средние и быстрые варианты, которые демонстрируют более быструю кинетику и большую чувствительность, чем соответствующие варианты jGCaMP7. [15]
Также были разработаны красные флуоресцентные индикаторы: jRCaMP1a и jRCaMP1b используют круговую перестановку красного флуоресцентного белка mRuby вместо GFP, тогда как jRGECO1a основан на красном флуоресцентном белке mApple. [12] [16] Поскольку синий свет, используемый для возбуждения GCaMP, рассеивается тканями, а излучаемый зеленый свет поглощается кровью, красные флуоресцентные индикаторы обеспечивают большее проникновение и глубину визуализации in vivo, чем GCaMP. Использование красных флуоресцентных индикаторов также позволяет избежать фотоповреждений, вызванных синим возбуждающим светом. [16] Более того, красные флуоресцентные индикаторы позволяют одновременно использовать оптогенетику , что затруднительно с GCaMP, потому что длины волн возбуждения GCaMP перекрываются с длинами волн канального родопсина-2 (ChR2). [16] [17] Одновременное использование красного и зеленого GECI может обеспечить двухцветную визуализацию различных субклеточных регионов или популяций клеток. [16] [17] [18]
Приложения в исследованиях
Нейронная активность
В нейронах потенциалы действия вызывают высвобождение нейромедиаторов в аксонов путем открытия напряжения закрытого типа Ca 2+ каналов , что позволяет Ca 2+ притока. В результате GCaMP обычно используется для измерения увеличения внутриклеточного Ca 2+ в нейронах в качестве заместителя нейрональной активности в нескольких моделях животных, включая Caenorhabditis elegans , рыбок данио , дрозофил и мышей . [19]
GCaMP сыграл жизненно важную роль в создании крупномасштабных нейронных записей у животных, чтобы исследовать, как паттерны активности в нейронных сетях влияют на поведение. Например, Nguyen et al. (2016) использовали GCaMP в визуализации всего мозга во время свободного движения C. elegans, чтобы идентифицировать нейроны и группы нейронов, активность которых коррелировала с определенным двигательным поведением. [20]
Muto et al. (2003) экспрессировали GCaMP в эмбрионах рыбок данио для измерения и картирования скоординированной активности спинномозговых мотонейронов в различных частях мозга во время начала, распространения и восстановления припадков, вызванных пентилентетразолом . [21] Экспрессия GCaMP в мозге рыбок данио также использовалась для изучения активации нейронных цепей в когнитивных процессах, таких как захват добычи, управление импульсами и внимание. [22] [23]
Кроме того, исследователи использовали GCaMP для наблюдения за нейрональной активностью у мышей, экспрессируя ее под контролем промотора Thy1 , который обнаружен в возбуждающих пирамидных нейронах . [24] Например, интеграция нейронов в цепи во время моторного обучения отслеживалась с помощью GCaMP для наблюдения синхронизированных паттернов колебаний уровней Ca 2+ . [25] [26] [27] GCaMP также использовался для наблюдения за динамикой Ca 2+ в субклеточных компартментах нейронов мышей: Cichon и Gan (2015) использовали GCaMP, чтобы показать, что нейроны в моторной коре головного мозга мышей демонстрируют вызванное NMDA увеличение в Ca 2+, которые являются независимыми для каждого дендритного шипа , таким образом показывая, что отдельные дендритные шипы регулируют синаптическую пластичность . [28] Наконец, GCaMP был использован для определения паттернов активности в определенных областях мозга мышей. Например, Jones et al. (2018) использовали GCaMP6 у мышей для измерения нейрональной активности в супрахиазматическом ядре (SCN), циркадном кардиостимуляторе млекопитающих , и показали, что нейроны SCN, продуцирующие вазоактивный кишечный пептид (VIP), демонстрируют ритмы суточной активности in vivo, которые коррелируют с высвобождением VIP. [29]
GCaMP также был объединен с волоконной фотометрией для измерения изменений Ca 2+ на уровне популяции внутри субпопуляций нейронов у свободно перемещающихся животных. [30] Например, Clarkson et al. (2017) использовал этот метод , чтобы показать , что нейроны в дугообразном ядре в гипоталамусе синхронизироваться с увеличением Ca 2+ непосредственно перед импульсами лютеинизирующего гормона (ЛГ). [31] Хотя визуализация GCaMP с помощью волоконной фотометрии не может отслеживать изменения в уровнях Ca 2+ в отдельных нейронах, она обеспечивает большее временное разрешение для крупномасштабных изменений. [32]
Сердечная проводимость
Токи Са 2+ через щелевые контакты кардиомиоцитов опосредуют синхронное сокращение сердечной ткани. В результате экспрессия GCaMP в кардиомиоцитах, как in vitro, так и in vivo , была использована для изучения Ca 2+ -зависимого возбуждения и сокращения у рыбок данио и мышей. [33] Например, Tallini et al. (2006) экспрессировали GCaMP2 в эмбрионах мышей, чтобы показать, что на эмбриональный день 10.5 электрическая проводимость была быстрой в предсердиях и желудочках, но медленной в атриовентрикулярном канале . [8] Chi et al. (2008) использовали трансгенную кардиоспецифичную линию GCaMP рыбок данио для визуализации активации кардиомиоцитов на протяжении сердечного цикла; По своим результатам они охарактеризовали четыре стадии развития системы сердечной проводимости рыбок данио и идентифицировали 17 новых мутаций, влияющих на сердечную проводимость. [34] Однако неконтролируемая экспрессия GCaMP приводит к гипертрофии сердца из-за сверхэкспрессии мотива кальмодулина, который препятствует передаче сигналов внутриклеточного кальция. В результате эксперименты с использованием сердечной ткани должны тщательно контролировать уровень экспрессии GCaMP. [8]
Активация сигнального пути
Поскольку Ca 2+ является обычным вторичным мессенджером, GCaMP использовался для мониторинга активации сигнальных путей. Например, Bonder и McCarthy (2014) использовали GCaMP, чтобы показать, что передача сигналов астроцитарного рецептора, сопряженного с G-белком (GPCR), и последующее высвобождение Ca 2+ не отвечает за нейрососудистое сцепление, процесс, посредством которого изменения нейрональной активности приводят к изменениям локальных кровоток. [35] Точно так же Грир и Беар и др. (2016) использовали GCaMP для характеристики динамики притока Ca 2+ в передаче сигналов обонятельного нейрона ожерелья , который использует трансмембранные белки MS4A в качестве хеморецепторов . [36]
Смотрите также
- Визуализация кальция
- Кальций в биологии
- Кальмодулин
- Камелеон (белок)
- Зеленый флуоресцентный белок
- Киназа легкой цепи миозина
Рекомендации
- ^ a b c Накай Дж., Окура М., Имото К. (февраль 2001 г.). «Зонд Ca (2+) с высоким отношением сигнал / шум, состоящий из одного зеленого флуоресцентного белка». Природа Биотехнологии . 19 (2): 137–41. DOI : 10,1038 / 84397 . PMID 11175727 . S2CID 30254550 .
- ^ а б в Чен Т.В., Уордилл Т.Дж., Сан Й., Пулвер С.Р., Реннингер С.Л., Баохан А. и др. (Июль 2013). «Сверхчувствительные флуоресцентные белки для визуализации нейрональной активности» . Природа . 499 (7458): 295–300. Bibcode : 2013Natur.499..295C . DOI : 10,1038 / природа12354 . PMC 3777791 . PMID 23868258 .
- ^ Барнетт Л.М., Хьюз Т.Э., Дробижев М. (2017-02-09). «Расшифровка молекулярного механизма, ответственного за Ca2 + -зависимое изменение флуоресценции GCaMP6m» . PLOS ONE . 12 (2): e0170934. Bibcode : 2017PLoSO..1270934B . DOI : 10.1371 / journal.pone.0170934 . PMC 5300113 . PMID 28182677 .
- ^ Уитакер М (01.01.2010). «Генетически закодированные зонды для измерения внутриклеточного кальция» . Методы клеточной биологии . 99 : 153–82. DOI : 10.1016 / B978-0-12-374841-6.00006-2 . ISBN 9780123748416. PMC 3292878 . PMID 21035686 .
- ^ а б Джи Джи, Фельдман М.Э., Дэн К.Ю., Грин К.С., Уилсон Дж., Ли Дж. К. и др. (Май 2004 г.). «Ca2 + -чувствительные трансгенные мыши: постсинаптическая передача сигналов в гладких мышцах». Журнал биологической химии . 279 (20): 21461–8. DOI : 10.1074 / jbc.M401084200 . PMID 14990564 . S2CID 9532711 .
- ^ Akerboom J, Rivera JD, Guilbe MM, Malavé EC, Hernandez HH, Tian L и др. (Март 2009 г.). «Кристаллические структуры кальциевого сенсора GCaMP раскрывают механизм изменения сигнала флуоресценции и способствуют рациональному проектированию» . Журнал биологической химии . 284 (10): 6455–64. DOI : 10.1074 / jbc.M807657200 . PMC 2649101 . PMID 19098007 .
- ^ Ван Кью, Шуй Б., Котликофф М.И., Сондерманн Х. (декабрь 2008 г.). «Структурная основа определения кальция с помощью GCaMP2» . Структура . 16 (12): 1817–27. DOI : 10.1016 / j.str.2008.10.008 . PMC 2614139 . PMID 19081058 .
- ^ а б в г Таллини Ю.Н., Окура М., Чой Б.Р., Джи Джи, Имото К., Доран Р. и др. (Март 2006 г.). «Визуализация клеточных сигналов в сердце in vivo: кардиальная экспрессия высокосигнального индикатора Ca2 + GCaMP2» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 103 (12): 4753–8. Bibcode : 2006PNAS..103.4753T . DOI : 10.1073 / pnas.0509378103 . PMC 1450242 . PMID 16537386 .
- ^ Тиан Л., Хайрес С.А., Мао Т., Хубер Д., Чиаппе М.Э., Чаласани С.Х. и др. (Декабрь 2009 г.). «Визуализация нейронной активности у червей, мух и мышей с улучшенными индикаторами кальция GCaMP» . Природные методы . 6 (12): 875–81. DOI : 10.1038 / nmeth.1398 . PMC 2858873 . PMID 19898485 .
- ^ Акербум Дж., Чен Т.В., Уордилл Т.Дж., Тиан Л., Марвин Дж. С., Мутлу С. и др. (Октябрь 2012 г.). «Оптимизация индикатора кальция GCaMP для визуализации нервной активности» . Журнал неврологии . 32 (40): 13819–40. DOI : 10.1523 / JNEUROSCI.2601-12.2012 . PMC 3482105 . PMID 23035093 .
- ^ а б Иноуэ М. (июнь 2020 г.). «Генетически закодированные индикаторы кальция для исследования динамики сложных цепей мозга in vivo». Неврологические исследования . DOI : 10.1016 / j.neures.2020.05.013 . PMID 32531233 . S2CID 219559849 .
- ^ а б в г Хэри Л. «Переход на GECO? Обзор датчиков кальция с кодировкой AAV» . blog.addgene.org . Проверено 6 мая 2021 .
- ^ Бассет Дж. Дж., Монтейт Г. Р. (01.01.2017). «Генетически закодированные индикаторы кальция как зонды для оценки роли кальциевых каналов в заболевании и для открытия высокопроизводительных лекарств». Ионные каналы Вниз Под. Успехи фармакологии. 79 . С. 141–171. DOI : 10.1016 / bs.apha.2017.01.001 . ISBN 9780128104132. PMID 28528667 .
- ^ Ян И, Лю Н, Хе И, Лю И, Гэ Л., Цзоу Л. и др. (Апрель 2018 г.). «Улучшенный датчик кальция GCaMP-X преодолевает нарушения кальциевых каналов, вызванные кальмодулином в GCaMP» . Nature Communications . 9 (1): 1504. Bibcode : 2018NatCo ... 9.1504Y . DOI : 10.1038 / s41467-018-03719-6 . PMC 5904127 . PMID 29666364 .
- ^ Zhang Y, Rózsa M, Bushey D, Reep D, Broussard GY, Tsang A и др. (2020). «Быстрые генетически закодированные индикаторы кальция jGCaMP8»: 361685 байт. DOI : 10,25378 / janelia.13148243.v4 . Цитировать журнал требует
|journal=
( помощь ) - ^ а б в г Дана Х., Мохар Б., Сан Й., Нараян С., Гордус А., Хассеман Дж. П. и др. (Март 2016 г.). Häusser M (ред.). «Чувствительные индикаторы кальция красного белка для визуализации нервной активности» . eLife . 5 : e12727. DOI : 10.7554 / eLife.12727 . PMC 4846379 . PMID 27011354 .
- ^ а б Акербум Дж., Каррерас Кальдерон Н., Тиан Л., Вабниг С., Пригге М., Толё Дж и др. (2013). «Генетически закодированные индикаторы кальция для многоцветной визуализации нейронной активности в сочетании с оптогенетикой» . Границы молекулярной неврологии . 6 : 2. дои : 10,3389 / fnmol.2013.00002 . PMC 3586699 . PMID 23459413 .
- ^ Чжао Ю., Араки С., Ву Дж., Терамото Т., Чанг Ю.Ф., Накано М. и др. (Сентябрь 2011 г.). «Расширенная палитра генетически закодированных индикаторов Ca²⁺» . Наука . 333 (6051): 1888–91. DOI : 10.1126 / science.1208592 . PMC 3560286 . PMID 21903779 .
- ^ Дана Х., Сан Й., Мохар Б., Халс Б.К., Керлин А.М., Хассеман Дж. П. и др. (Июль 2019 г.). «Высокоэффективные датчики кальция для визуализации активности нейрональных популяций и микрокомпартментов». Природные методы . 16 (7): 649–657. DOI : 10.1038 / s41592-019-0435-6 . PMID 31209382 . S2CID 189927684 .
- ^ Нгуен Дж. П., Шипли Ф. Б., Линдер А. Н., Пламмер Г. С., Лю М., Сетру С.У. и др. (Февраль 2016). «Визуализация кальция всего мозга с клеточным разрешением у свободно ведущих Caenorhabditis elegans» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 113 (8): E1074-81. arXiv : 1501.03463 . Bibcode : 2016PNAS..113E1074N . DOI : 10.1073 / pnas.1507110112 . PMC 4776509 . PMID 26712014 .
- ^ Муто А., Окура М., Котани Т., Хигасиджима С., Накаи Дж., Каваками К. (март 2011 г.). «Генетическая визуализация с улучшенным индикатором кальция GCaMP показывает пространственно-временную активацию спинномозговых мотонейронов у рыбок данио» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 108 (13): 5425–30. Bibcode : 2011PNAS..108.5425M . DOI : 10.1073 / pnas.1000887108 . PMC 3069178 . PMID 21383146 .
- ^ Муто А, Каваками К. (2013). «Захват добычи личинками рыбок данио служит моделью для изучения когнитивных функций» . Границы в нейронных цепях . 7 : 110. DOI : 10,3389 / fncir.2013.00110 . PMC 3678101 . PMID 23781176 .
- ^ Паркер МО, Брок А.Дж., Уолтон Р.Т., Бреннан С.Х. (2013). «Роль рыбок данио (Danio rerio) в анализе генетики и нейронных цепей исполнительной функции» . Границы в нейронных цепях . 7 : 63. DOI : 10,3389 / fncir.2013.00063 . PMC 3619107 . PMID 23580329 .
- ^ Chen Q, Cichon J, Wang W, Qiu L, Lee SJ, Campbell NR и др. (Октябрь 2012 г.). «Визуализация нейронной активности с использованием трансгенных мышей Thy1-GCaMP» . Нейрон . 76 (2): 297–308. DOI : 10.1016 / j.neuron.2012.07.011 . PMC 4059513 . PMID 23083733 .
- ^ Питерс А.Дж., Чен С.Х., Комияма Т. (июнь 2014). «Возникновение воспроизводимой пространственно-временной активности при двигательном обучении». Природа . 510 (7504): 263–7. Bibcode : 2014Natur.510..263P . DOI : 10,1038 / природа13235 . PMID 24805237 . S2CID 4463927 .
- ^ Зив Й., Бернс Л.Д., Кокер Э.Д., Хамель Э.О., Гош К.К., Китч Л.Дж. и др. (Март 2013 г.). «Долговременная динамика кодов мест гиппокампа CA1» . Природа Неврологии . 16 (3): 264–6. DOI : 10.1038 / nn.3329 . PMC 3784308 . PMID 23396101 .
- ^ Линь М.З., Шнитцер М.Дж. (август 2016 г.). «Генетически закодированные индикаторы нейронной активности» . Природа Неврологии . 19 (9): 1142–53. DOI : 10.1038 / nn.4359 . PMC 5557009 . PMID 27571193 .
- ^ Cichon J, Gan WB (апрель 2015 г.). «Специфичные для ветвей дендритные шипы Ca (2+) вызывают стойкую синаптическую пластичность» . Природа . 520 (7546): 180–5. Bibcode : 2015Natur.520..180C . DOI : 10,1038 / природа14251 . PMC 4476301 . PMID 25822789 .
- ^ Джонс-младший, Саймон Т., Лонес Л., Херцог Э.Д. (сентябрь 2018 г.). «Нейроны SCN VIP необходимы для нормального опосредованного светом восстановления циркадной системы» . Журнал неврологии . 38 (37): 7986–7995. DOI : 10.1523 / JNEUROSCI.1322-18.2018 . PMC 6596148 . PMID 30082421 .
- ^ Хан С.Ю., Кларксон Дж., Пит Р., Хербисон А.Е. (ноябрь 2018 г.). «Оптические подходы к исследованию нейронных цепей, контролирующих секрецию гормонов». Эндокринология . 159 (11): 3822–3833. DOI : 10.1210 / en.2018-00594 . PMID 30304401 .
- ^ Кларксон Дж., Хан С.Ю., Пит Р., МакЛеннан Т., Кейн Г.М., Нг Дж. И др. (Ноябрь 2017 г.). «Определение гипоталамического генератора импульсов ГнРГ у мышей» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 114 (47): E10216 – E10223. DOI : 10.1073 / pnas.1713897114 . PMC 5703322 . PMID 29109258 .
- ^ Gunaydin LA, Grosenick L, Finkelstein JC, Kauvar IV, Fenno LE, Adhikari A, et al. (Июнь 2014 г.). «Естественная динамика нейронных проекций, лежащая в основе социального поведения» . Cell . 157 (7): 1535–51. DOI : 10.1016 / j.cell.2014.05.017 . PMC 4123133 . PMID 24949967 .
- ^ Кестнер Л., Шольц А., Тиан К., Руппенталь С., Табеллион В., Визен К. и др. (Май 2014 г.). «Генетически кодируемые индикаторы Са2 + в сердечных миоцитах». Циркуляционные исследования . 114 (10): 1623–39. DOI : 10,1161 / CIRCRESAHA.114.303475 . PMID 24812351 .
- ^ Chi NC, Shaw RM, Jungblut B, Huisken J, Ferrer T., Arnaout R, et al. (Май 2008 г.). «Генетическое и физиологическое вскрытие проводящей системы сердца позвоночных» . PLOS Биология . 6 (5): e109. DOI : 10.1371 / journal.pbio.0060109 . PMC 2430899 . PMID 18479184 .
- ^ Bonder DE, McCarthy KD (сентябрь 2014 г.). «Астроцитарный Gq-GPCR-связанный IP3R-зависимая передача сигналов Ca2 + не опосредует нейроваскулярное соединение в зрительной коре головного мозга мышей in vivo» . Журнал неврологии . 34 (39): 13139–50. DOI : 10.1523 / JNEUROSCI.2591-14.2014 . PMC 4172806 . PMID 25253859 .
- ^ Грир П.Л., Медведь Д.М., Лассанс Дж.М., Блум М.Л., Цукахара Т., Пашковски С.Л. и др. (Июнь 2016 г.). «Семейство хемосенсоров, не относящихся к GPCR, определяет альтернативную логику обоняния млекопитающих» . Cell . 165 (7): 1734–1748. DOI : 10.1016 / j.cell.2016.05.001 . PMC 4912422 . PMID 27238024 .