Нокдаун гена является экспериментальным методом , с помощью которой экспрессия одного или нескольких из организма «ы генов уменьшается. Снижение может происходить либо посредством генетической модификации, либо путем обработки реагентом, таким как короткая ДНК или РНК- олигонуклеотид , последовательность которого комплементарна либо гену, либо транскрипту мРНК. [1]
Против временного нокдауна
Если ДНК организма генетически модифицирована, полученный организм называется «нокдаун-организмом». Если изменение экспрессии гена вызвано связыванием олигонуклеотида с мРНК или временным связыванием с геном , это приводит к временному изменению экспрессии гена, которое не модифицирует хромосомную ДНК, и результат называется «временный нокдаун». ". [1]
При временном нокдауне связывание этого олигонуклеотида с активным геном или его транскриптами вызывает снижение экспрессии посредством различных процессов. Связывание может происходить либо через блокирование транскрипции (в случае гена связывания), деградации мРНК транскрипта (например , с помощью малых интерферирующих РНК ( киРНК )) или РНКазы - H зависит антисмысловой или через блокирование либо мРНК перевода сайты сплайсинга пре-м РНК или сайты расщепления нуклеазой, используемые для созревания других функциональных РНК, включая миРНК (например, морфолиноолигонуклеотидами или другими антисмысловыми антисмысловыми элементами от РНКазы-H). [1] [2]
Наиболее прямое использование временных нокдаунов - это изучение гена , который был секвенирован , но имеет неизвестную или не полностью известную функцию. Этот экспериментальный подход известен как обратная генетика . Исследователи делают выводы из того, чем нокдаун отличается от людей, у которых работает интересующий ген. Временные нокдауны часто используются в биологии развития, потому что олигонуклеотиды могут быть введены в одноклеточные зиготы и будут присутствовать в дочерних клетках инъецированной клетки в процессе эмбрионального развития. [3] Термин "нокдаун гена" впервые появился в литературе в 1994 г. [4]
РНК-интерференция
РНК-интерференция (РНКи) - это средство подавления генов посредством деградации мРНК. [5] Нокдаун гена с помощью этого метода достигается путем введения небольших двухцепочечных интерферирующих РНК (миРНК) в цитоплазму. Небольшие интерферирующие РНК могут происходить изнутри клетки или могут вводиться в клетку экзогенно. После введения в клетку экзогенные миРНК процессируются РНК-индуцированным комплексом сайленсинга ( RISC ). [6] siRNA комплементарна целевой мРНК, которая должна быть заглушена, и RISC использует siRNA в качестве матрицы для определения местоположения целевой мРНК. После того, как RISC локализуется на целевой мРНК, РНК расщепляется рибонуклеазой.
РНКи широко используется в качестве лабораторного метода генетического функционального анализа. [7] РНКи в организмах, таких как C. elegans и Drosophila melanogaster, обеспечивает быстрое и недорогое средство исследования функции генов. В исследованиях C. elegans наличие таких инструментов, как библиотека Ahringer RNAi, дает лабораториям возможность тестировать многие гены в различных экспериментальных условиях. Информация, полученная в результате экспериментального использования РНКи, может быть полезна для определения потенциальных терапевтических целей, разработки лекарств или других приложений. [8] РНК-интерференция - очень полезный инструмент исследования, позволяющий исследователям проводить большие генетические скрининги в попытке определить цели для дальнейших исследований, связанных с конкретным путем, лекарством или фенотипом. [9] [10]
CRISPR
Другой способ подавления экзогенной ДНК, который был обнаружен у прокариот, - это механизм, включающий локусы, называемые «кластерные регулярные короткие палиндромные повторы» или CRISPR . [11] CRISPR-ассоциированные (cas) гены кодируют клеточный аппарат, который разрезает экзогенную ДНК на небольшие фрагменты и вставляет их в локус повтора CRISPR. Когда эта CRISPR-область ДНК экспрессируется клеткой, малые РНК, полученные из экзогенных вставок ДНК, служат в качестве матричной последовательности, которую используют другие Cas-белки, чтобы заглушить эту же экзогенную последовательность. Транскрипты коротких экзогенных последовательностей используются в качестве руководства, чтобы заглушить эти чужеродные ДНК, когда они присутствуют в клетке. Это служит своего рода приобретенным иммунитетом, и этот процесс подобен механизму интерференции прокариотической РНК. В CRISPR повторы сохраняются среди многих видов , и были продемонстрированы , чтобы быть полезными в клетках человека, [12] бактерия, [13] C. Элеганс , [14] данио , [15] и другие организмы , для эффективной манипуляции генома. Использование CRISPR в качестве универсального исследовательского инструмента можно проиллюстрировать [16] многими исследованиями, в которых он используется для создания организмов с изменениями генома.
ТАЛЕНЫ
Другая технология, ставшая возможной благодаря манипуляциям с прокариотическим геномом, - это использование эффекторных нуклеаз, подобных активатору транскрипции ( TALEN ), для нацеливания на определенные гены. [17] TALEN - это нуклеазы, которые имеют два важных функциональных компонента: домен связывания ДНК и домен расщепления ДНК. ДНК-связывающий домен представляет собой последовательность-специфичную эффекторную последовательность, подобную активатору транскрипции, в то время как ДНК-расщепляющий домен происходит от бактериальной эндонуклеазы и является неспецифическим. TALEN могут быть сконструированы для расщепления последовательности, определенной последовательностью эффекторной части конструкции, подобной активатору транскрипции. После создания TALEN вводится в клетку в виде плазмиды или мРНК. TALEN экспрессируется, локализуется в своей целевой последовательности и расщепляет определенный сайт. После расщепления целевой последовательности ДНК посредством TALEN клетка использует негомологичное соединение концов в качестве механизма репарации ДНК для коррекции расщепления. Попытка клетки восстановить расщепленную последовательность может сделать кодируемый белок нефункциональным, поскольку этот механизм репарации вносит ошибки вставки или удаления в репарированном сайте.
Коммерциализация
До сих пор нокдаун-организмы с постоянными изменениями в их ДНК были созданы в основном для исследовательских целей. Эти организмы, также известные как нокдауны , чаще всего используются для обратной генетики, особенно у таких видов, как мыши или крысы, для которых нелегко применить технологии временного нокдауна. [3] [18]
Есть несколько компаний, которые предлагают коммерческие услуги, связанные с лечением нокдауна генов.
Смотрите также
- Джин нокаут
Рекомендации
- ^ a b c Саммертон Дж. Э. (2007). «Сравнение морфолино, миРНК и S-ДНК: влияние структуры и механизма действия на нецелевые эффекты и специфичность последовательности». Актуальные темы медицинской химии . 7 (7): 651–60. DOI : 10.2174 / 156802607780487740 . PMID 17430206 . S2CID 12241724 .
- ^ Саммертон Дж. (Декабрь 1999 г.). «Морфолино-антисмысловые олигомеры: случай независимого от РНКазы Н структурного типа». Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Структура и экспрессия генов . 1489 (1): 141–58. DOI : 10.1016 / S0167-4781 (99) 00150-5 . PMID 10807004 .
- ^ а б Насевичюс А., Эккер СК (октябрь 2000 г.). «Эффективный целевой ген« нокдаун »у рыбок данио». Генетика природы . 26 (2): 216–20. DOI : 10.1038 / 79951 . PMID 11017081 . S2CID 21451111 .
- ^ Валестедт, Клаас (февраль 1994 г.). «Антисмысловые олигонуклеотидные стратегии в нейрофармакологии». Trends Pharmacol Sci . 15 (2): 42–6. DOI : 10.1016 / 0165-6147 (94) 90107-4 . PMID 8165722 .
- ^ Огонь А., Сюй С., Монтгомери М.К., Костас С.А., Драйвер С.Е., Мелло СС (февраль 1998 г.). «Сильное и специфическое генетическое вмешательство двухцепочечной РНК в Caenorhabditis elegans». Природа . 391 (6669): 806–11. DOI : 10.1038 / 35888 . PMID 9486653 . S2CID 4355692 .
- ^ Пратт А.Дж., Макрей И.Дж. (июль 2009 г.). «РНК-индуцированный комплекс подавления звука: универсальная машина подавления генов» . Журнал биологической химии . 284 (27): 17897–901. DOI : 10.1074 / jbc.R900012200 . PMC 2709356 . PMID 19342379 .
- ^ Fraser AG, Kamath RS, Zipperlen P, Martinez-Campos M, Sohrmann M, Ahringer J (ноябрь 2000 г.). «Функциональный геномный анализ хромосомы I C. elegans путем систематической интерференции РНК». Природа . 408 (6810): 325–30. DOI : 10.1038 / 35042517 . PMID 11099033 . S2CID 4373444 .
- ^ Aagaard L, Росси JJ (март 2007 г.). «РНКи-терапия: принципы, перспективы и проблемы» . Расширенные обзоры доставки лекарств . 59 (2–3): 75–86. DOI : 10.1016 / j.addr.2007.03.005 . PMC 1978219 . PMID 17449137 .
- ^ Камат Р.С., Арингер Дж. (Август 2003 г.). «Полногеномный скрининг РНКи у Caenorhabditis elegans». Методы . 30 (4): 313–21. DOI : 10.1016 / S1046-2023 (03) 00050-1 . PMID 12828945 .
- ^ Ghadakzadeh S, Mekhail M, Aoude A, Hamdy R, Tabrizian M (март 2016 г.). «Маленькие игроки, управляющие жесткой игрой: миРНК в регенерации костей» . Журнал исследований костей и минералов . 31 (3): 475–87. DOI : 10.1002 / jbmr.2816 . PMID 26890411 .
- ^ Гилберт Л.А., Ларсон М.Х., Морсут Л., Лю З., Брар Г.А., Торрес С.Е., Стерн-Джиноссар Н., Брандман О., Уайтхед Е.Х., Дудна Д.А., Лим В.А., Вайсман Д.С., Ци Л.С. (июль 2013 г.). «CRISPR-опосредованная модульная РНК-управляемая регуляция транскрипции у эукариот» . Cell . 154 (2): 442–51. DOI : 10.1016 / j.cell.2013.06.044 . PMC 3770145 . PMID 23849981 .
- ^ Эсвелт К.М., Мали П., Брафф Дж.Л., Моосбернер М., Яунг С.Дж., Church GM (ноябрь 2013 г.). «Ортогональные белки Cas9 для регуляции и редактирования генов под управлением РНК» (PDF) . Природные методы . 10 (11): 1116–21. DOI : 10.1038 / nmeth.2681 . PMC 3844869 . PMID 24076762 .
- ^ Цзян В., Бикард Д., Кокс Д., Чжан Ф., Марраффини Л.А. (март 2013 г.). «РНК-управляемое редактирование бактериальных геномов с использованием систем CRISPR-Cas» . Природа Биотехнологии . 31 (3): 233–9. DOI : 10.1038 / nbt.2508 . PMC 3748948 . PMID 23360965 .
- ^ Чен С., Фенк Л.А., де Боно М. (ноябрь 2013 г.). «Эффективное редактирование генома Caenorhabditis elegans с помощью CRISPR-целевой гомологичной рекомбинации» . Исследования нуклеиновых кислот . 41 (20): e193. DOI : 10.1093 / NAR / gkt805 . PMC 3814388 . PMID 24013562 .
- ^ Хисано Ю., Ота С., Кавахара А. (январь 2014 г.). «Редактирование генома с использованием искусственных сайт-специфичных нуклеаз у рыбок данио» . Развитие, рост и дифференциация . 56 (1): 26–33. DOI : 10.1111 / dgd.12094 . PMID 24117409 .
- ^ Геннекен Б., Отте Д.М., Циммер А. (ноябрь 2013 г.). «CRISPR / Cas-индуцированные двухцепочечные разрывы увеличивают частоту замен генов для гуманизации гена Cnr2 мыши». Сообщения о биохимических и биофизических исследованиях . 441 (4): 815–9. DOI : 10.1016 / j.bbrc.2013.10.138 . PMID 24211574 .
- ^ Сун Н., Чжао Х (июль 2013 г.). «Эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (TALEN): высокоэффективный и универсальный инструмент для редактирования генома». Биотехнология и биоинженерия . 110 (7): 1811–21. DOI : 10.1002 / bit.24890 . PMID 23508559 . S2CID 6214542 .
- ^ «Клетки нокдауна аденовирусных генов» . Sirion Biotech. Архивировано из оригинала 9 июля 2013 года . Проверено 17 апреля 2013 года .
Внешние ссылки
- "Ресурсы инженерии генома CRISPR" . Широкий институт.
- «Рука Моджо: создавайте свои собственные талены» . Клиника Мэйо.
- "TALEN Effector Nucleotide Targeter 2.0" . Cornell University.