Рекомбинация in vitro
Рекомбинантная ДНК (рДНК) или молекулярное клонирование — это процесс, при котором один ген или сегмент ДНК выделяют и амплифицируют . Рекомбинантная ДНК также известна как рекомбинация in vitro . Клонирующий вектор — это молекула ДНК, которая переносит чужеродную ДНК в клетку- хозяина , где она реплицируется, производя множество своих копий вместе с чужеродной ДНК. Существует много типов клонирующих векторов, таких как плазмиды и фаги . Для проведения рекомбинации между вектором и чужеродной ДНК необходимо, чтобы вектор и ДНК были клонированы путем расщепления ., лигировать чужеродную ДНК в вектор с помощью ферментной ДНК- лигазы . И ДНК вставляется путем введения ДНК в клетки бактерий путем трансформации .
Существует два основных источника чужеродной ДНК для молекулярного клонирования: геномная ДНК (гДНК) и комплементарная (или копирующая) ДНК (кДНК). Молекулы кДНК представляют собой ДНК-копии молекул мРНК , продуцируемые in vitro под действием фермента обратной транскриптазы . Чтобы получить кДНК для определенного гена, сначала необходимо создать библиотеку кДНК .
Интересующая ДНК должна быть фрагментирована , чтобы получить соответствующий сегмент ДНК подходящего размера. Подготовку фрагментов ДНК для клонирования осуществляют с помощью ПЦР , но ее также можно осуществить путем расщепления рестрикционными ферментами и фракционирования с помощью гель-электрофореза .
Чтобы подготовить библиотеку кДНК, первым шагом является выделение общей мРНК из интересующего типа клеток. Затем для создания кДНК используется фермент обратная транскриптаза. Обратная транскриптаза представляет собой РНК-зависимую ДНК-полимеразу. Это зависит от наличия праймера, обычно поли-dT олигонуклеотида , для праймирования синтеза ДНК.. ДНК-полимераза может использовать эти одноцепочечные праймеры для инициации синтеза второй цепи ДНК на матрицах мРНК. После того, как одноцепочечные молекулы ДНК преобразуются в двухцепочечные молекулы ДНК с помощью ДНК-полимеразы, их встраивают в векторы и клонируют. Для этого кДНК часто метилируют специфичной метилтрансферазой. Эти синтетические олигонуклеотиды могут быть либо «линкерами», либо «липкими» выступами, образующимися путем расщепления подходящим ферментом рестрикции.
Векторы рекомбинантной ДНК функционируют как носители чужеродной ДНК. Плазмиды представляют собой небольшие замкнутые молекулы ДНК, которые существуют из хромосом своего хозяина. Их репликация должна находиться под строгим контролем (низкое число копий) или ослабленным (высокое число копий). Сайты рестрикции, называемые сайтами множественного клонирования или полилинкерами , дают широкий выбор сайтов рестрикции для использования на этапе клонирования.
.svg)
