Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

См. Также: вакцина РНК и трансфекция

Трансфекция РНК - это процесс преднамеренного введения РНК в живую клетку . РНК может быть очищен из клеток после лизиса или синтезируют из свободных нуклеотидов либо химически, либо ферментативно с использованием РНК - полимеразы к транскрибировать в ДНК шаблон. Как и в случае с ДНК, РНК может быть доставлена ​​в клетки различными способами, включая микроинъекцию , электропорацию и трансфекцию, опосредованную липидами . Если РНК кодирует белок , трансфицированные клетки могут транслироватьРНК в кодируемый белок. Если РНК является регуляторной РНК (такой как миРНК ), РНК может вызывать другие изменения в клетке (например, опосредованный РНКи нокдаун ).

Инкапсуляция молекулы РНК в липидные наночастицы была прорывом в производстве жизнеспособных РНК-вакцин , позволившим преодолеть ряд ключевых технических препятствий на пути доставки молекулы РНК в клетку человека. [1] [2]

Терминология [ править ]

Молекулы РНК короче примерно 25 нм в значительной степени ускользают от обнаружения врожденной иммунной системой , которая запускается более длинными молекулами РНК. Большинство клеток организма экспрессируют белки врожденной иммунной системы, и при воздействии экзогенных длинных молекул РНК эти белки инициируют сигнальные каскады, которые приводят к воспалению . Это воспаление повышает чувствительность пораженной клетки и близлежащих клеток к последующему воздействию. В результате, хотя клетка может быть повторно трансфицирована короткой РНК с небольшими неспецифическими эффектами, повторная трансфекция клеток даже небольшим количеством длинной РНК может вызвать гибель клетки, если не будут приняты меры для подавления или уклонения от врожденной иммунной системы (см. «Трансфекция длинной РНК» ниже).

Трансфекция короткой РНК [ править ]

Трансфекция короткой РНК обычно используется в биологических исследованиях для подавления экспрессии интересующего белка (с использованием миРНК ) или для экспрессии или блокирования активности миРНК (с использованием короткой РНК, которая действует независимо от аппарата РНКи клетки и, следовательно, является не упоминается как siRNA). В то время как векторы на основе ДНК ( вирусы , плазмиды ), которые кодируют короткую молекулу РНК, также могут использоваться, трансфекция короткой РНК не подвергает риску модификацию ДНК клетки, что привело к развитию короткой РНК как нового класса макромолекулярные препараты . [3]

Трансфекция длинной РНК [ править ]

Трансфекция длинной РНК - это процесс преднамеренного введения молекул РНК длиной более 25 нт в живые клетки. Различают трансфекцию короткой и длинной РНК, потому что экзогенные длинные молекулы РНК вызывают в клетках врожденный иммунный ответ, который может вызывать множество неспецифических эффектов, включая блокировку трансляции , остановку клеточного цикла и апоптоз .

Эндогенная и экзогенная длинная РНК [ править ]

Врожденная иммунная система эволюционировала для защиты от инфекции путем обнаружения молекулярных паттернов, связанных с патогенами (PAMP), и запуска сложного набора ответов, известных под общим названием « воспаление ». Многие клетки экспрессируют специфические рецепторы распознавания образов (РРСС) для экзогенной РНК в том числе платных-подобный рецептор 3,7,8 ( TLR3 , TLR7 , TLR8 ), [4] [5] [6] [7] РНК геликазы RIG1 (RARRES3) , [8] протеинкиназа R (PKR, также известная как EIF2AK2), [9] [10]члены семейства белков олигоаденилатсинтетазы ( OAS1 , OAS2 , OAS3 ) и другие. Все эти белки могут специфически связываться с молекулами экзогенной РНК и вызывать иммунный ответ. Конкретные химические, структурные или другие характеристики длинных молекул РНК, которые необходимы для распознавания PRR, остаются в значительной степени неизвестными, несмотря на интенсивные исследования. В любой момент времени типичная клетка млекопитающего может содержать несколько сотен тысяч мРНК и других регуляторных длинных молекул РНК . Как клетки отличают экзогенную длинную РНК от большого количества эндогенной длинной РНК, является важным открытым вопросом в клеточной биологии . Несколько отчетов предполагают, что фосфорилирование5'-конца длинной молекулы РНК может влиять на ее иммуногенность , и, в частности, 5'-трифосфатная РНК, которая может образовываться во время вирусной инфекции, является более иммуногенной, чем 5'-дифосфатная РНК, 5'-монофосфатная РНК или РНК не содержит 5 'фосфата. [11] [12] [13] [14] [15] [16] Тем не менее, длинная РНК, транскрибируемая in vitro (ivT), содержащая 7-метилгуанозиновый кэп (присутствует в мРНК эукариот ), также обладает высокой иммуногенностью, несмотря на отсутствие 5 ' фосфат, [17] предполагая, что характеристики, отличные от 5'-фосфорилирования, могут влиять на иммуногенность молекулы РНК.

Эукариотическая мРНК содержит химически модифицированные нуклеотиды, такие как N 6 -метиладенозин , 5-метилцитидин и 2'-O-метилированные нуклеотиды. Хотя только очень небольшое количество этих модифицированных нуклеотидов присутствует в типичной молекуле мРНК, они могут помочь предотвратить активацию мРНК врожденной иммунной системы путем нарушения вторичной структуры , которая напоминала бы двухцепочечную РНК (дцРНК) [6], тип Считается, что РНК присутствует в клетках только во время вирусной инфекции. Иммуногенность длинной РНК использовалась для изучения как врожденного, так и адаптивного иммунитета .

Повторная трансфекция длинной РНК [ править ]

Ингибирования только трех белков, интерферона-β , STAT2 и EIF2AK2 достаточно для спасения человеческих фибробластов от гибели клеток, вызванной частой трансфекцией длинной, кодирующей белок РНК. [17] Ингибирование передачи сигналов интерферона нарушает петлю положительной обратной связи, которая обычно вызывает гиперчувствительность клеток, подвергшихся воздействию экзогенной длинной РНК. Недавно исследователи использовали эту технику для экспрессии белков репрограммирования в первичных фибробластах человека . [18]

См. Также [ править ]

  • РНК-вакцины

Ссылки [ править ]

  1. ↑ Куни, Элизабет (1 декабря 2020 г.). «Как нанотехнологии помогают мРНК вакцины Covid-19 работать» . Стат . Дата обращения 3 декабря 2020 .
  2. ↑ Фоли, Кэтрин Эллен (22 декабря 2020 г.). «Первые вакцины против Covid-19 навсегда изменили биотехнологию» . Кварц . Кварц Медиа . Проверено 11 января 2021 года .
  3. ^ Тансей В (11 августа 2006). «Лечение дегенерации желтого пятна препятствует передаче сообщений РНК» . Хроники Сан-Франциско.
  4. ^ Alexopoulou L, Холт AC, Меджиты R, Флэйвеллы RA (2001). «Распознавание двухцепочечной РНК и активация NF-kappaB Toll-подобным рецептором 3». Природа . 413 (6857): 732–738. DOI : 10.1038 / 35099560 . PMID 11607032 . S2CID 4346537 .  
  5. ^ Kariko К, Ni Н, Capodici Дж, Lamphier М, Вайсман D (2004). «мРНК является эндогенным лигандом для Toll-подобного рецептора 3» . J Biol Chem . 279 (13): 12542–12550. DOI : 10.1074 / jbc.M310175200 . PMID 14729660 . 
  6. ^ a b Карико К., Бакштейн М, Ни Х, Вайсман Д. (2005). «Подавление распознавания РНК Toll-подобными рецепторами: влияние модификации нуклеозидов и эволюционное происхождение РНК». Иммунитет . 23 (2): 165–175. DOI : 10.1016 / j.immuni.2005.06.008 . PMID 16111635 . 
  7. ^ Diebold С.С., Kaisho Т, Хемй Н, Akira S, Reis е Соуз С (2004). «Врожденные противовирусные ответы посредством TLR7-опосредованного распознавания одноцепочечной РНК». Наука . 303 (5663): 1529–1531. DOI : 10.1126 / science.1093616 . PMID 14976261 . S2CID 33144196 .  
  8. ^ Йониам М, Кикучи М, Natsukawa Т, Shinobu Н, Имайдзуй Т, и др. (2004). «РНК-геликаза RIG-I играет важную роль в врожденных противовирусных реакциях, индуцированных двухцепочечной РНК». Nat Immunol . 5 (7): 730–737. DOI : 10.1038 / ni1087 . PMID 15208624 . S2CID 34876422 .  
  9. ^ Das HK, Das A, Ghosh-Dastidar P, Ralston RO, Yaghmai B и др. (1981). «Синтез белка в ретикулоцитах кролика. Очистка и характеристика двухцепочечного РНК-зависимого ингибитора синтеза белка из лизатов ретикулоцитов». J Biol Chem . 256 (12): 6491–6495. PMID 7240221 . 
  10. ^ Левин DH, Петришин R, London IM (1981). «Характеристика очищенной двухцепочечной РНК-активированной eIF-2 альфа-киназы из ретикулоцитов кролика». J Biol Chem . 256 (14): 7638–7641. PMID 6265457 . 
  11. ^ Хорнанг В, Ellegast Дж, Ким S, Brzozka К, Юнг А, и др. (2006). «5'-трифосфатная РНК является лигандом для RIG-I». Наука . 314 (5801): 994–997. DOI : 10.1126 / science.1132505 . PMID 17038590 . S2CID 22436759 .  
  12. ^ Сайто Т; Оуэн DM; Цзян Ф; Маркотриджиано Дж; Гейл М-младший (2008). «Врожденный иммунитет, индуцированный зависимым от состава RIG-I распознаванием РНК вируса гепатита С» . Природа . 454 (7203): 523–527. DOI : 10,1038 / природа07106 . PMC 2856441 . PMID 18548002 .  
  13. ^ Такахаси К., Йонеяма М, Нишихори Т., Хираи Р., Кумета Х. и др. (2008). «Механизм восприятия несамостоятельной РНК геликазы RIG-I и активация противовирусных иммунных ответов». Mol Cell . 29 (4): 428–440. DOI : 10.1016 / j.molcel.2007.11.028 . PMID 18242112 . 
  14. ^ Йониам М, Фуджит Т (2008). «Структурный механизм распознавания РНК RIG-I-подобными рецепторами». Иммунитет . 29 (2): 178–181. DOI : 10.1016 / j.immuni.2008.07.009 . PMID 18701081 . 
  15. ^ Шмидт А., Шверд Т., Хамм В., Хельмут Дж. К., Цуй С. и др. (2009). «5'-трифосфатная РНК требует структур со спаренными основаниями для активации противовирусной передачи сигналов через RIG-I» . Proc Natl Acad Sci USA . 106 (29): 12067–12072. DOI : 10.1073 / pnas.0900971106 . PMC 2705279 . PMID 19574455 .  
  16. ^ Schlee M, Roth A, Hornung V, Hagmann CA, Wimmenauer V и др. (2009). «Для распознавания 5'-трифосфата с помощью геликазы RIG-I требуется короткая тупая двухцепочечная РНК, содержащаяся в ручке отрицательной цепи вируса» . Иммунитет . 31 (1): 25–34. DOI : 10.1016 / j.immuni.2009.05.008 . PMC 2824854 . PMID 19576794 .  
  17. ^ а б Ангел M, Яник MF (2010). «Подавление врожденного иммунитета делает возможной частую трансфекцию с помощью кодирующих репрограммирующих белков РНК» . PLOS ONE . 5 (7): e11756. DOI : 10.1371 / journal.pone.0011756 . PMC 2909252 . PMID 20668695 .  
  18. ^ Trafton A (26 июля 2010). «РНК предлагает более безопасный способ перепрограммировать клетки» . MIT News Office.

Внешние ссылки [ править ]

  • Трансфекция ДНК и РНК , Природа (2020}