Секвенирование ДНК - это процесс определения последовательности нуклеиновой кислоты - порядка нуклеотидов в ДНК . Он включает в себя любой метод или технологию, которые используются для определения порядка четырех оснований: аденина , гуанина , цитозина и тимина . Появление методов быстрого секвенирования ДНК значительно ускорило биологические и медицинские исследования и открытия. [1] [2]
Знание последовательностей ДНК стало незаменимым для фундаментальных биологических исследований и во многих прикладных областях, таких как медицинская диагностика , биотехнология , судебная биология , вирусология и биологическая систематика . Сравнение здоровых и мутированных последовательностей ДНК может диагностировать различные заболевания, включая различные виды рака, [3] охарактеризовать репертуар антител [4] и может использоваться для руководства лечением пациентов. [5] Наличие быстрого способа секвенирования ДНК позволяет оказывать более быструю и индивидуализированную медицинскую помощь, а также идентифицировать и каталогизировать большее количество организмов. [4]
Высокая скорость секвенирования, достигаемая с помощью современной технологии секвенирования ДНК, сыграла важную роль в секвенировании полных последовательностей ДНК или геномов многих типов и видов жизни, включая геном человека и другие полные последовательности ДНК многих животных, растений и микробов. разновидность.
Первые последовательности ДНК были получены в начале 1970-х академическими исследователями с использованием трудоемких методов, основанных на двумерной хроматографии . После разработки флуоресценции -На методов секвенирования с секвенсор ДНК , [6] секвенирование ДНК стало проще и порядков быстрее. [7]
Приложения
Секвенирование ДНК может использоваться для определения последовательности отдельных генов , более крупных генетических областей (то есть кластеров генов или оперонов ), полных хромосом или полных геномов любого организма. Секвенирование ДНК также является наиболее эффективным способом непрямого секвенирования РНК или белков (через их открытые рамки считывания ). Фактически, секвенирование ДНК стало ключевой технологией во многих областях биологии и других наук, таких как медицина, судебная экспертиза и антропология .
Молекулярная биология
Секвенирование используется в молекулярной биологии для изучения геномов и белков, которые они кодируют. Информация, полученная с помощью секвенирования, позволяет исследователям идентифицировать изменения в генах, ассоциации с заболеваниями и фенотипами, а также определять потенциальные мишени для лекарств.
Эволюционная биология
Поскольку ДНК представляет собой информативную макромолекулу с точки зрения передачи от одного поколения к другому, секвенирование ДНК используется в эволюционной биологии для изучения того, как разные организмы связаны между собой и как они развивались. В феврале 2021 года ученые впервые сообщили о секвенировании ДНК из останков животных , в данном случае мамонта, возрастом более миллиона лет, - самой старой ДНК, секвенированной на сегодняшний день. [8] [9]
Метагеномика
Область метагеномики включает идентификацию организмов, присутствующих в водоеме, сточных водах , грязи, отфильтрованном из воздуха мусоре или образцах мазков от организмов. Знание, какие организмы присутствуют в конкретной среде, имеет решающее значение для исследований в области экологии , эпидемиологии , микробиологии и других областях. Секвенирование позволяет исследователям определить, например, какие типы микробов могут присутствовать в микробиоме .
Вирусология
Поскольку большинство вирусов слишком малы, чтобы их можно было увидеть в световой микроскоп, секвенирование является одним из основных инструментов вирусологии для идентификации и изучения вируса. [10] Вирусные геномы могут быть основаны на ДНК или РНК. РНК-вирусы более чувствительны ко времени для секвенирования генома, поскольку они быстрее разлагаются в клинических образцах. [11] Традиционное секвенирование по Сэнгеру и секвенирование нового поколения используются для секвенирования вирусов в фундаментальных и клинических исследованиях, а также для диагностики возникающих вирусных инфекций, молекулярной эпидемиологии вирусных патогенов и тестирования лекарственной устойчивости. В GenBank более 2,3 миллиона уникальных вирусных последовательностей . [10] В последнее время NGS превзошел традиционный метод Сэнгера как самый популярный метод создания вирусных геномов. [10]
Во время вспышки птичьего гриппа в 1990 году секвенирование вирусов определило, что подтип гриппа возник в результате пересортировки между перепелами и домашней птицей. Это привело к принятию в Гонконге законодательства , запрещающего совместную продажу живых перепелов и птицы на рынке. Секвенирование вирусов также можно использовать для оценки начала вирусной вспышки с помощью метода молекулярных часов . [11]
Медицина
Медицинские техники могут секвенировать гены (или, теоретически, полные геномы) пациентов, чтобы определить, существует ли риск генетических заболеваний. Это форма генетического тестирования , хотя некоторые генетические тесты могут не включать секвенирование ДНК. Кроме того, секвенирование ДНК может быть полезно для определения конкретных бактерий, чтобы обеспечить более точное лечение антибиотиками , тем самым снижая риск создания устойчивости к противомикробным препаратам в популяциях бактерий. [12] [13] [14] [15] [16] [17]
Криминалистика
Секвенирование ДНК может использоваться наряду с методами профилирования ДНК для судебно-медицинской идентификации [18] и установления отцовства . За последние несколько десятилетий тестирование ДНК претерпело огромные изменения, и в конечном итоге позволило связать отпечаток ДНК с тем, что находится под следствием. Образцы ДНК в отпечатках пальцев, слюне, волосяных фолликулах и т. Д. Уникальным образом отделяют каждый живой организм от другого. Тестирование ДНК - это метод, который может обнаруживать определенные геномы в цепи ДНК для создания уникального и индивидуального рисунка.
Четыре канонических основы
Каноническая структура ДНК состоит из четырех оснований: тимина (Т), аденина (А), цитозина (С) и гуанина (G). Секвенирование ДНК - это определение физического порядка этих оснований в молекуле ДНК. Однако есть много других оснований, которые могут присутствовать в молекуле. В некоторых вирусах (в частности, бактериофаге ) цитозин может быть заменен гидроксиметилом или гидроксиметил цитозином глюкозы. [19] В ДНК млекопитающих могут быть обнаружены вариантные основания с метильными группами или фосфосульфатом. [20] [21] В зависимости от метода секвенирования конкретная модификация, например 5mC ( 5-метилцитозин ), распространенная у людей, может быть обнаружена или не обнаружена. [22]
История
Открытие структуры и функции ДНК
Дезоксирибонуклеиновая кислота ( ДНК ) была впервые обнаружена и выделена Фридрихом Мишером в 1869 году, но она оставалась малоизученной в течение многих десятилетий, потому что считалось, что белки, а не ДНК, содержат генетический план жизни. Эта ситуация изменилась после 1944 года в результате некоторых экспериментов Освальда Эйвери , Колина Маклауда и Маклина Маккарти, продемонстрировавших, что очищенная ДНК может превращать один штамм бактерий в другой. Это был первый случай, когда ДНК была показана способность трансформировать свойства клеток.
В 1953 году Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик предложили свою модель двойной спирали ДНК, основанную на кристаллизованных рентгеновских структурах, которые изучала Розалинд Франклин . Согласно модели, ДНК состоит из двух цепочек нуклеотидов, намотанных друг на друга, связанных водородными связями и движущихся в противоположных направлениях. Каждая цепь состоит из четырех комплементарных нуклеотидов - аденина (A), цитозина (C), гуанина (G) и тимина (T) - с A на одной цепи всегда в паре с T на другой, а C всегда в паре с G. Они предположили, что такая структура позволяет использовать каждую нить для реконструкции другой, и это центральная идея для передачи наследственной информации от поколения к поколению. [23]
Основа для секвенирования белков была впервые заложена работой Фредерика Сэнгера, который к 1955 году завершил последовательность всех аминокислот в инсулине , небольшом протеине, секретируемом поджелудочной железой. Это стало первым убедительным доказательством того, что белки были химическими образованиями с определенным молекулярным паттерном, а не случайной смесью веществ, взвешенных в жидкости. Успех Сэнгера в секвенировании инсулина вдохновил исследователей-рентгеновских кристаллографов, в том числе Уотсона и Крика, которые к настоящему времени пытались понять, как ДНК направляет образование белков в клетке. Вскоре после посещения серии лекций, прочитанных Фредериком Сэнгером в октябре 1954 года, Крик начал развивать теорию, согласно которой расположение нуклеотидов в ДНК определяет последовательность аминокислот в белках, что, в свою очередь, помогает определить функцию белка. Он опубликовал эту теорию в 1958 г. [24]
Секвенирование РНК
Секвенирование РНК было одной из самых ранних форм секвенирования нуклеотидов. Основным ориентиром в секвенировании РНК является последовательность первого полного гена и полного генома бактериофага MS2 , идентифицированная и опубликованная Уолтером Файерсом и его сотрудниками из Гентского университета ( Гент , Бельгия ) в 1972 [25] и 1976 годах. [26] Традиционные методы секвенирования РНК требуют создания молекулы кДНК , которую необходимо секвенировать. [27]
Методы раннего секвенирования ДНК
Первый метод определения последовательностей ДНК включал стратегию локализационного удлинения праймера, установленную Рэем Ву из Корнельского университета в 1970 году. [28] Катализ ДНК-полимеразой и специфическое мечение нуклеотидов, которые занимают видное место в современных схемах секвенирования, были использованы для секвенирования когезионные концы ДНК лямбда-фага. [29] [30] [31] Между 1970 и 1973 годами Ву, Р. Падманабхан и его коллеги продемонстрировали, что этот метод может быть использован для определения любой последовательности ДНК с использованием синтетических локально-специфичных праймеров. [32] [33] [34] Фредерик Сэнгер затем применил эту стратегию удлинения праймеров для разработки более быстрых методов секвенирования ДНК в Центре MRC , Кембридж , Великобритания, и опубликовал метод «секвенирования ДНК с помощью ингибиторов обрыва цепи» в 1977 году. [35] Уолтер Гилберт и Аллан Максам из Гарварда также разработали методы секвенирования, в том числе метод «секвенирования ДНК путем химической деградации». [36] [37] В 1973 году Гилберт и Максам сообщили о последовательности из 24 пар оснований, используя метод, известный как анализ блуждающих точек. [38] Достижениям в области секвенирования способствовало одновременное развитие технологии рекомбинантной ДНК , позволяющей выделять образцы ДНК из источников, отличных от вирусов.
Секвенирование полных геномов
Первым полным ДНК-геномом, который был секвенирован, был геном бактериофага φX174 в 1977 году. [39] В 1984 году ученые Совета медицинских исследований расшифровали полную последовательность ДНК вируса Эпштейна-Барра , обнаружив, что он содержит 172 282 нуклеотида. Завершение последовательности ознаменовало собой важный поворотный момент в секвенировании ДНК, потому что это было достигнуто без предварительного знания генетического профиля вируса. [40]
Нерадиоактивный метод переноса молекул ДНК из реакционных смесей секвенирования на иммобилизирующую матрицу во время электрофореза был разработан Гербертом Полом и его сотрудниками в начале 1980-х годов. [41] [42] Вслед за коммерциализацией секвенатора ДНК "Система прямого блоттинга-электрофореза GATC 1500" от GATC Biotech , который интенсивно использовался в рамках программы секвенирования генома ЕС, полная последовательность ДНК хромосома II дрожжей Saccharomyces cerevisiae . [43] Лаборатория Лероя Э. Гуда в Калифорнийском технологическом институте объявила о выпуске первой полуавтоматической машины для секвенирования ДНК в 1986 году. [44] За этим последовал маркетинг первой полностью автоматизированной машины для секвенирования ABI 370 от Applied Biosystems. , в 1987 г. и Dupont's Genesis 2000 [45], которые использовали новую технику флуоресцентного мечения, позволяющую идентифицировать все четыре дидезоксинуклеотида на одной дорожке. К 1990 году Национальный институт здравоохранения США (NIH) начал крупномасштабные испытания секвенирования Mycoplasma capricolum , Escherichia coli , Caenorhabditis elegans и Saccharomyces cerevisiae по цене 0,75 доллара США за основу. Тем временем в лаборатории Крейга Вентера началось секвенирование последовательностей кДНК человека , называемых метками экспрессируемых последовательностей , в попытке захватить кодирующую часть генома человека . [46] В 1995 году Вентер, Гамильтон Смит и его коллеги из Института геномных исследований (TIGR) опубликовали первый полный геном свободноживущего организма, бактерии Haemophilus influenzae . Круглая хромосома содержит 1830137 оснований, и ее публикация в журнале Science [47] ознаменовала первое опубликованное использование полногеномного секвенирования, устраняющее необходимость в первоначальных усилиях по картированию.
К 2001 году методы секвенирования с дробовиком были использованы для получения черновой последовательности генома человека. [48] [49]
Методы высокопроизводительного секвенирования (HTS)
В середине и конце 1990-х годов было разработано несколько новых методов секвенирования ДНК, которые к 2000 году были реализованы в коммерческих секвенаторах ДНК . Вместе они были названы методами секвенирования «следующего поколения» или «второго поколения» (NGS) по порядку. чтобы отличить их от более ранних методов, включая секвенирование по Сэнгеру . В отличие от первого поколения секвенирования, технология NGS обычно отличается высокой масштабируемостью, что позволяет секвенировать сразу весь геном. Обычно это достигается путем фрагментации генома на мелкие кусочки, случайной выборки фрагмента и его секвенирования с использованием одной из множества технологий, таких как описанные ниже. Целый геном возможен, потому что несколько фрагментов секвенируются одновременно (что дает название «массово-параллельное» секвенирование) в автоматизированном процессе.
Технология NGS дала огромные возможности исследователям искать информацию о здоровье, антропологам - исследовать происхождение человека, и стала катализатором движения « Персонализированная медицина ». Однако это также открыло путь к большему количеству ошибок. Существует множество программных инструментов для проведения вычислительного анализа данных NGS, каждый со своим собственным алгоритмом. Даже параметры в одном программном пакете могут изменить результат анализа. Кроме того, большое количество данных, полученных с помощью секвенирования ДНК, также потребовало разработки новых методов и программ для анализа последовательностей. Было предпринято несколько попыток разработать стандарты в области NGS для решения этих проблем, большинство из которых были небольшими усилиями, предпринятыми отдельными лабораториями. Совсем недавно крупная организованная работа, финансируемая FDA, завершилась разработкой стандарта BioCompute .
26 октября 1990 г. Роджер Цзян , Пепи Росс, Маргарет Фанесток и Аллан Дж. Джонстон подали патент, описывающий пошаговое («основание за основанием») секвенирование с помощью съемных 3'-блокаторов на массивах ДНК (блоты и отдельные молекулы ДНК). [51] В 1996 году Пол Нюрен и его студент Мостафа Ронаги из Королевского технологического института в Стокгольме опубликовали свой метод пиросеквенирования . [52]
1 апреля 1997 года Паскаль Майер и Лоран Фаринелли подали во Всемирную организацию интеллектуальной собственности патенты, описывающие секвенирование колоний ДНК. [53] пробоподготовки ДНК и случайное поверхностно полимеразной цепной реакции (ПЦР) выстроив способы , описанные в этом патенте, в сочетании с Roger Tsien и др. В «базовой по-базе» метод секвенирования, теперь реализован в Illumina «S Секвенсоры генома Hi-Seq.
В 1998 году Фил Грин и Брент Юинг из Вашингтонского университета описали свой показатель качества phred для анализа данных секвенатора [54], знаковый метод анализа, получивший широкое распространение и до сих пор являющийся наиболее распространенным показателем для оценки точности секвенирования. Платформа. [55]
Lynx Therapeutics опубликовала и представила на рынке массовое параллельное секвенирование сигнатур (MPSS) в 2000 году. Этот метод включал в себя параллельную, опосредованную адаптером / лигированием технологию секвенирования на основе гранул и служил первым коммерчески доступным методом секвенирования «следующего поколения», хотя и не Секвенаторы ДНК были проданы независимым лабораториям. [56]
Основные методы
Секвенирование Максама-Гилберта
Аллан Максам и Уолтер Гилберт опубликовали метод секвенирования ДНК в 1977 году, основанный на химической модификации ДНК и последующем расщеплении по определенным основаниям. [36] Этот метод, также известный как химическое секвенирование, позволял использовать очищенные образцы двухцепочечной ДНК без дальнейшего клонирования. Использование радиоактивного мечения в этом методе и его техническая сложность препятствовали его широкому использованию после того, как методы Сэнгера были усовершенствованы.
Секвенирование Maxam-Gilbert требует радиоактивной маркировки на одном 5'-конце ДНК и очистки фрагмента ДНК, который необходимо секвенировать. Затем химическая обработка приводит к разрыву небольшого количества одного или двух из четырех нуклеотидных оснований в каждой из четырех реакций (G, A + G, C, C + T). Концентрация модифицирующих химикатов контролируется для введения в среднем одной модификации на молекулу ДНК. Таким образом образуется серия меченых фрагментов от конца с радиоактивной меткой до первого «разрезанного» сайта в каждой молекуле. Фрагменты в четырех реакциях подвергают электрофорезу бок о бок в денатурирующих акриламидных гелях для разделения по размеру. Для визуализации фрагментов гель экспонируют на рентгеновской пленке для авторадиографии, получая серию темных полос, каждая из которых соответствует радиоактивно меченному фрагменту ДНК, из которых можно сделать вывод о последовательности. [36]
Методы завершения цепи
Метод обрыва цепи, разработанный Фредериком Сэнгером и его сотрудниками в 1977 году, вскоре стал предпочтительным методом из-за его относительной простоты и надежности. [35] [57] При изобретении метода обрыва цепи использовалось меньше токсичных химикатов и меньшее количество радиоактивности, чем в методе Максама и Гилберта. Из-за своей сравнительной простоты метод Сэнгера вскоре был автоматизирован и стал методом, используемым в первом поколении секвенаторов ДНК .
Секвенирование по Сэнгеру - метод, который преобладал с 1980-х до середины 2000-х годов. За этот период были достигнуты большие успехи в таких технологиях, как флуоресцентное маркирование, капиллярный электрофорез и общая автоматизация. Эти разработки позволили значительно повысить эффективность секвенирования, что привело к снижению затрат. Метод Сенгера в массовом производстве - это технология, позволившая получить первый геном человека в 2001 году, положив начало эпохе геномики . Однако позже в этом десятилетии на рынке появились радикально иные подходы, в результате чего стоимость одного генома снизилась со 100 миллионов долларов в 2001 году до 10 000 долларов в 2011 году [58].
Крупномасштабное секвенирование и De Novo секвенирование
Крупномасштабное секвенирование часто направлено на секвенирование очень длинных фрагментов ДНК, таких как целые хромосомы , хотя крупномасштабное секвенирование также может использоваться для создания очень большого количества коротких последовательностей, таких как обнаруженные на фаговом дисплее . Для более длинных мишеней, таких как хромосомы, общие подходы состоят в разрезании (с помощью рестрикционных ферментов ) или разрезании (с помощью механических сил) больших фрагментов ДНК на более короткие фрагменты ДНК. Затем фрагментированную ДНК можно клонировать в вектор ДНК и амплифицировать в бактериальном хозяине, таком как Escherichia coli . Короткие фрагменты ДНК, очищенные из отдельных бактериальных колоний, индивидуально секвенируют и собирают электронным способом в одну длинную непрерывную последовательность. Исследования показали, что добавление этапа выбора размера для сбора фрагментов ДНК одинакового размера может повысить эффективность секвенирования и точность сборки генома. В этих исследованиях автоматическая калибровка оказалась более воспроизводимой и точной, чем ручная калибровка геля. [59] [60] [61]
Термин « секвенирование de novo » конкретно относится к методам, используемым для определения последовательности ДНК без ранее известной последовательности. De novo переводится с латыни как «с самого начала». Пробелы в собранной последовательности могут быть заполнены путем прогулок праймера . Различные стратегии имеют разные компромиссы в скорости и точности; Методы дробовика часто используются для секвенирования больших геномов, но его сборка сложна и трудна, особенно с повторами последовательностей, часто вызывающими пробелы в сборке генома.
Большинство подходов к секвенированию используют этап клонирования in vitro для амплификации отдельных молекул ДНК, поскольку их методы молекулярного обнаружения недостаточно чувствительны для секвенирования отдельных молекул. Эмульсионная ПЦР [62] изолирует отдельные молекулы ДНК вместе с покрытыми праймером шариками в водных каплях в масляной фазе. Затем с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) каждая гранула покрывается клональными копиями молекулы ДНК с последующей иммобилизацией для последующего секвенирования. ПЦР эмульсии используется в методах, разработанных Marguilis et al. (коммерциализируется 454 Life Sciences ), Shendure and Porreca et al. (также известное как « секвенирование полонии ») и секвенирование SOLiD (разработано Agencourt , позже Applied Biosystems , теперь Life Technologies ). [63] [64] [65] ПЦР эмульсии также используется в платформах GemCode и Chromium, разработанных 10x Genomics . [66]
Секвенирование дробовика
Секвенирование дробовиком - это метод секвенирования, разработанный для анализа последовательностей ДНК длиной более 1000 пар оснований, вплоть до целых хромосом. Этот метод требует, чтобы целевая ДНК была разбита на случайные фрагменты. После секвенирования отдельных фрагментов последовательности могут быть повторно собраны на основе их перекрывающихся областей. [67]
Методы с высокой пропускной способностью
Высокопроизводительное секвенирование, которое включает методы секвенирования следующего поколения «короткое считывание» и «долгое считывание» третьего поколения [nt 1], применяется к секвенированию экзома, секвенированию генома, повторному секвенированию генома, профилированию транскриптома ( RNA-Seq ), ДНК-белковые взаимодействия ( ChIP-секвенирование ) и характеристика эпигенома . [68] Повторное секвенирование необходимо, потому что геном одного человека вида не будет указывать на все вариации генома среди других особей того же вида.
Высокий спрос на дешевое секвенирование стимулировал развитие технологий секвенирования с высокой пропускной способностью, которые распараллеливают процесс секвенирования, создавая одновременно тысячи или миллионы последовательностей. [69] [70] [71] Технологии высокопроизводительного секвенирования призваны снизить стоимость секвенирования ДНК по сравнению с тем, что возможно при использовании стандартных методов определения терминатора с использованием красителя. [72] При секвенировании со сверхвысокой пропускной способностью до 500 000 операций секвенирования путем синтеза могут выполняться параллельно. [73] [74] [75] Такие технологии позволили секвенировать весь геном человека всего за один день. [76] По состоянию на 2019 год[Обновить], корпоративными лидерами в разработке продуктов для высокопроизводительного секвенирования были компании Illumina , Qiagen и ThermoFisher Scientific . [76]
Метод | Прочитать длину | Точность (однократное чтение, а не консенсус) | Чтений за прогон | Время на запуск | Стоимость на 1 миллиард баз (в долларах США) | Преимущества | Недостатки |
---|---|---|---|---|---|---|---|
Секвенирование одной молекулы в реальном времени (Pacific Biosciences) | 30 000 п.н. ( N50 ); максимальная длина чтения> 100 000 оснований [79] [80] [81] | Точность необработанного считывания 87% [82] | 4 000 000 на ячейку SMRT Sequel 2, 100–200 гигабаз [79] [83] [84] | От 30 минут до 20 часов [79] [85] | 7,2–43,3 долл. США | Быстрый. Обнаруживает 4 мкКл, 5 мкКл, 6 мА. [86] | Умеренная пропускная способность. Оборудование может быть очень дорогим. |
Ионный полупроводник (секвенирование ионного торрента) | до 600 п.н. [87] | 99,6% [88] | до 80 миллионов | 2 часа | 66,8–950 долларов | Менее дорогое оборудование. Быстрый. | Гомополимерные ошибки. |
Пиросеквенирование (454) | 700 п.н. | 99,9% | 1 миллион | 24 часа | 10 000 долл. США | Длинный размер чтения. Быстрый. | Пробежки дорогие. Гомополимерные ошибки. |
Секвенирование путем синтеза (Illumina) | MiniSeq, NextSeq: 75–300 п.н .; MiSeq: 50–600 п.н .; HiSeq 2500: 50–500 п.н .; HiSeq 3/4000: 50–300 п.н .; HiSeq X: 300 п.н. | 99,9% (Phred30) | MiniSeq / MiSeq: 1–25 миллионов; NextSeq: 130-00 миллионов; HiSeq 2500: 300 миллионов - 2 миллиарда; HiSeq 3/4000 2,5 миллиарда; HiSeq X: 3 миллиарда | От 1 до 11 дней, в зависимости от секвенсора и указанной длины чтения [89] | От 5 до 150 долларов | Возможность высокого выхода секвенирования в зависимости от модели секвенсора и желаемого применения. | Оборудование может быть очень дорогим. Требуется высокая концентрация ДНК. |
Комбинаторный синтез якоря зонда (cPAS-BGI / MGI) | BGISEQ-50: 35-50 бп; MGISEQ 200: 50-200 б.п.; BGISEQ-500, MGISEQ-2000: 50–300 б.п. [90] | 99,9% (Phred30) | БГИСЭК-50: 160М; MGISEQ 200: 300M; BGISEQ-500: 1300M на проточную кювету; MGISEQ-2000: проточная кювета FCS 375M, проточная кювета FCL 1500M на каждую проточную кювету. | От 1 до 9 дней в зависимости от прибора, длины считывания и количества одновременных запусков проточных кювет. | 5–120 долларов США | ||
Секвенирование лигированием (SOLiD-секвенирование) | 50 + 35 или 50 + 50 б.п. | 99,9% | От 1,2 до 1,4 миллиарда | 1-2 недели | 60–130 долл. США | Низкая стоимость базы. | Медленнее, чем другие методы. Имеет проблемы с секвенированием палиндромных последовательностей. [91] |
Секвенирование нанопор | Это зависит от подготовки библиотеки, а не от устройства, поэтому пользователь выбирает длину чтения (сообщается до 2 272 580 пар оснований [92] ). | ~ 92–97% однократного чтения | зависит от длины чтения, выбранной пользователем | данные передаются в режиме реального времени. Выберите от 1 минуты до 48 часов | 7–100 долларов США | Самый длинный человек читает. Доступное сообщество пользователей. Портативный (размером с ладонь). | Более низкая пропускная способность, чем у других машин, точность однократного считывания за 90 секунд. |
Секвенирование GenapSys | Около 150 п.н. односторонний | 99,9% (Phred30) | От 1 до 16 миллионов | Около 24 часов | 667 долл. США | Низкая стоимость инструмента (10 000 долларов США). | |
Обрыв цепи (секвенирование по Сэнгеру) | От 400 до 900 п.н. | 99,9% | N / A | От 20 минут до 3 часов | 2 400 000 долл. США | Полезно для многих приложений. | Более дорого и непрактично для больших проектов секвенирования. Этот метод также требует трудоемкого этапа клонирования плазмиды или ПЦР. |
Долгосрочные методы секвенирования
Секвенирование одиночных молекул в реальном времени (SMRT)
Секвенирование SMRT основано на подходе секвенирования путем синтеза. ДНК синтезируется в волноводах нулевой моды (ZMW) - небольших хорошо похожих на сосуды контейнерах с инструментами для улавливания, расположенными на дне скважины. Секвенирование выполняется с использованием немодифицированной полимеразы (прикрепленной к основанию ZMW) и флуоресцентно меченных нуклеотидов, свободно протекающих в растворе. Лунки сконструированы таким образом, что детектируется только флуоресценция, возникающая на дне лунки. Флуоресцентная метка отделяется от нуклеотида после его включения в цепь ДНК, оставляя немодифицированную цепь ДНК. По словам разработчика технологии SMRT Pacific Biosciences (PacBio), эта методология позволяет обнаруживать модификации нуклеотидов (например, метилирование цитозина). Это происходит благодаря наблюдению за кинетикой полимеразы. Этот подход позволяет считывать 20 000 нуклеотидов и более при средней длине считывания 5 килобаз. [83] [93] В 2015 году Pacific Biosciences объявила о запуске нового инструмента для секвенирования под названием Sequel System с 1 миллионом ZMW по сравнению с 150 000 ZMW в инструменте PacBio RS II. [94] [95] SMRT-секвенирование называется секвенированием « третьего поколения » или «долгим чтением».
Секвенирование ДНК с помощью нанопор
ДНК, проходящая через нанопору, изменяет свой ионный ток. Это изменение зависит от формы, размера и длины последовательности ДНК. Каждый тип нуклеотида блокирует поток ионов через пору в течение разного периода времени. Метод не требует модифицированных нуклеотидов и выполняется в режиме реального времени. Секвенирование нанопор упоминается как секвенирование « третьего поколения » или «долгое чтение», наряду с секвенированием SMRT.
Ранние промышленные исследования этого метода были основаны на методе, называемом «секвенирование экзонуклеаз», при котором считывание электрических сигналов происходило по мере того, как нуклеотиды проходили через поры альфа (α) -гемолизина, ковалентно связанные с циклодекстрином . [96] Однако последующий коммерческий метод, «секвенирование цепи», секвенировал основания ДНК в интактной цепи.
Двумя основными направлениями развития секвенирования нанопор являются твердотельное секвенирование нанопор и секвенирование нанопор на основе белков. При секвенировании белковых нанопор используются мембранные белковые комплексы, такие как α-гемолизин, MspA ( Mycobacterium smegmatis Porin A) или CssG, которые демонстрируют большие перспективы, учитывая их способность различать отдельные нуклеотиды и группы. [97] Напротив, в твердотельном секвенировании нанопор используются синтетические материалы, такие как нитрид кремния и оксид алюминия, и это предпочтительнее из-за их превосходных механических свойств, а также термической и химической стабильности. [98] Метод изготовления важен для этого типа секвенирования, учитывая, что массив нанопор может содержать сотни пор с диаметром менее восьми нанометров. [97]
Эта концепция возникла из идеи, что одноцепочечные молекулы ДНК или РНК могут электрофоретически управляться в строгой линейной последовательности через биологическую пору, размер которой может составлять менее восьми нанометров, и может быть обнаружен, учитывая, что молекулы выделяют ионный ток при движении через поры. Пора содержит область обнаружения, способную распознавать разные основания, при этом каждая база генерирует различные временные сигналы, соответствующие последовательности оснований, когда они пересекают пору, которые затем оцениваются. [98] Точный контроль над транспортом ДНК через поры имеет решающее значение для успеха. Различные ферменты, такие как экзонуклеазы и полимеразы, были использованы для смягчения этого процесса, располагая их возле входа в поры. [99]
Краткосрочные методы секвенирования
Массивно-параллельное секвенирование сигнатур (MPSS)
Первая из технологий высокопроизводительного секвенирования, массовое параллельное секвенирование сигнатур (или MPSS), была разработана в 1990-х годах в Lynx Therapeutics, компании, основанной в 1992 году Сидни Бреннером и Сэмом Элетром . MPSS был методом на основе шариков, который использовал комплексный подход лигирования адаптера с последующим декодированием адаптера, считывая последовательность с шагом в четыре нуклеотида. Этот метод сделал его чувствительным к смещению, специфичному для последовательности, или потере конкретных последовательностей. Поскольку технология была настолько сложной, MPSS выполнялась только «внутри компании» Lynx Therapeutics, и никакие машины для секвенирования ДНК не продавались независимым лабораториям. Lynx Therapeutics объединилась с Solexa (позже приобретенная Illumina ) в 2004 году, что привело к развитию секвенирования путем синтеза, более простого подхода, приобретенного у Manteia Predictive Medicine , что сделало MPSS устаревшим. Однако основные свойства вывода MPSS были типичными для более поздних типов данных с высокой пропускной способностью, включая сотни тысяч коротких последовательностей ДНК. В случае MPSS они обычно использовались для секвенирования кДНК для измерения уровней экспрессии генов . [56]
Секвенирование полонии
Полоните-секвенирование метод, разработанные в лаборатории Джордж М. Церкви Гарвардского университета, была одним из первых высоких пропускной способности систем секвенирования , и была использована для последовательности полного E.coli , геном в 2005 году [100] Это в сочетании в пробирке paired- tag библиотеки с эмульсионной ПЦР, автоматизированным микроскопом и химией секвенирования на основе лигирования для секвенирования генома E. coli с точностью> 99,9999% и стоимостью примерно 1/9 стоимости секвенирования по Сэнгеру. [100] Лицензия на технологию была передана Agencourt Biosciences, впоследствии была преобразована в Agencourt Personal Genomics и в конечном итоге включена в платформу Applied Biosystems SOLiD. Позднее Applied Biosystems была приобретена компанией Life Technologies , которая теперь является частью Thermo Fisher Scientific .
454 пиросеквенирование
Параллельная версия пиросеквенирования была разработана компанией 454 Life Sciences , которая с тех пор была приобретена Roche Diagnostics . Метод амплифицирует ДНК внутри капель воды в масляном растворе (эмульсионная ПЦР), при этом каждая капля содержит одну матрицу ДНК, прикрепленную к одной покрытой праймером бусине, которая затем образует клональную колонию. Машина для секвенирования содержит множество пиколитровых лунок, каждая из которых содержит одну гранулу и ферменты для секвенирования. При пиросеквенировании люцифераза используется для генерации света для обнаружения отдельных нуклеотидов, добавленных к формирующейся ДНК, а объединенные данные используются для создания считываний последовательностей . [63] Эта технология обеспечивает промежуточную длину чтения и цену за базу по сравнению с секвенированием по Сэнгеру на одном конце и Solexa и SOLiD на другом. [72]
Секвенирование Illumina (Solexa)
Solexa , ныне часть Illumina , была основана Шанкаром Баласубраманианом и Дэвидом Кленерманом в 1998 году и разработала метод секвенирования, основанный на технологии обратимых терминаторов красителей и инженерных полимераз. [101] Концепция обратимой терминированной химии была изобретена Бруно Канардом и Саймоном Сарфати в Институте Пастера в Париже. [102] [103] Он был разработан внутри компании Solexa лицами, указанными в соответствующих патентах. В 2004 году Solexa приобрела компанию Manteia Predictive Medicine , чтобы получить технологию массового параллельного секвенирования, изобретенную в 1997 году Паскалем Майером и Лораном Фаринелли. [53] Он основан на «кластерах ДНК» или «колониях ДНК», который включает клональную амплификацию ДНК на поверхности. Кластерная технология была приобретена совместно с Lynx Therapeutics of California. Позже Solexa Ltd. объединилась с Lynx и образовала Solexa Inc.
В этом методе молекулы ДНК и праймеры сначала прикрепляются к предметному стеклу или проточной кювете и амплифицируются с помощью полимеразы, так что образуются локальные клональные колонии ДНК, позже названные «кластерами ДНК». Для определения последовательности добавляют четыре типа оснований обратимых терминаторов (RT-оснований) и смывают невключенные нуклеотиды. Камера делает снимки флуоресцентно меченных нуклеотидов. Затем краситель вместе с концевым 3'-блокатором химически удаляется из ДНК, позволяя начать следующий цикл. В отличие от пиросеквенирования, цепи ДНК удлиняются на один нуклеотид за раз, и получение изображения может выполняться с задержкой, что позволяет захватывать очень большие массивы колоний ДНК с помощью последовательных изображений, полученных с одной камеры.
Разделение ферментативной реакции и захвата изображения обеспечивает оптимальную производительность и теоретически неограниченную емкость секвенирования. Таким образом, при оптимальной конфигурации максимально достижимая производительность инструмента определяется исключительно коэффициентом аналого-цифрового преобразования камеры, умноженным на количество камер и разделенным на количество пикселей на колонию ДНК, необходимое для их оптимальной визуализации (приблизительно 10 пикселей / колония). В 2012 году с камерами, работающими с частотой аналого-цифрового преобразования более 10 МГц, и доступной оптикой, жидкостями и ферментами, пропускная способность может быть кратной 1 миллиону нуклеотидов в секунду, что примерно соответствует 1 эквиваленту генома человека при 1x охвате в час на каждый прибор. и 1 геном человека повторно секвенировали (примерно с 30-кратным увеличением) в день на инструмент (оборудованный единственной камерой). [104]
Комбинаторный синтез якоря зонда (cPAS)
Этот метод является усовершенствованной модификацией технологии лигирования якоря комбинаторного зонда (cPAL), описанной Complete Genomics [105], которая с тех пор стала частью китайской геномной компании BGI в 2013 году. [106] Обе компании усовершенствовали технологию, чтобы обеспечить более длительное считывание. продолжительность, сокращение времени реакции и более быстрое получение результатов. Кроме того, данные теперь генерируются как непрерывные полноразмерные чтения в стандартном формате файла FASTQ и могут использоваться как есть в большинстве конвейеров биоинформатического анализа на основе короткого чтения. [107] [ необходима цитата ]
Две технологии, которые составляют основу этой высокопроизводительной технологии секвенирования, - это наношарики ДНК (DNB) и структурированные массивы для прикрепления наношаров к твердой поверхности. [105] Наношарики ДНК образуются просто путем денатурирования двухцепочечных библиотек с лигированием адаптеров и лигирования прямой цепи только со сплинтовым олигонуклеотидом с образованием круга оцДНК. Достоверные копии кругов, содержащих вставку ДНК, производятся с использованием амплификации вращающегося круга, которая генерирует примерно 300–500 копий. Длинная цепь оцДНК складывается сама по себе, образуя трехмерную структуру наношара, диаметр которой составляет приблизительно 220 нм. Создание DNB заменяет необходимость создания ПЦР-копий библиотеки на проточной кювете и, как таковое, может удалить большую часть повторяющихся считываний, лигирования адаптер-адаптер и ошибок, вызванных ПЦР. [107] [ необходима цитата ]
Узорчатый массив положительно заряженных пятен изготавливается с помощью методов фотолитографии и травления с последующей химической модификацией для создания проточной ячейки секвенирования. Каждое пятно на проточной кювете имеет диаметр примерно 250 нм, разделено 700 нм (от центра к центру) и позволяет легко прикрепить один отрицательно заряженный DNB к проточной кювете и, таким образом, уменьшить недостаточную или чрезмерную кластеризацию на проточной кювете. [105] [ необходима цитата ]
Затем выполняется секвенирование путем добавления олигонуклеотидного зонда, который присоединяется в комбинации к определенным сайтам внутри DNB. Зонд действует как якорь, который затем позволяет одному из четырех одиночных обратимо инактивированных меченых нуклеотидов связываться после прохождения через проточную кювету. Несвязанные нуклеотиды вымываются перед лазерным возбуждением прикрепленных меток, затем излучают флуоресценцию, и сигнал улавливается камерами, которые преобразуются в цифровой выход для определения основания. Присоединенное основание имеет терминатор и метку, химически расщепленную по завершении цикла. Цикл повторяется с другим потоком свободных меченых нуклеотидов через проточную кювету, чтобы позволить следующему нуклеотиду связываться и улавливать его сигнал. Этот процесс будет завершен несколько раз (обычно от 50 до 300 раз) , чтобы определить последовательность вставленного участка ДНК со скоростью примерно 40 миллионов нуклеотидов в секунду по состоянию на 2018. [ править ]
SOLiD секвенирование
Технология SOLiD от Applied Biosystems (теперь бренд Life Technologies ) использует секвенирование путем лигирования . Здесь пул всех возможных олигонуклеотидов фиксированной длины помечен в соответствии с положением в последовательности. Олигонуклеотиды отжигаются и лигируются; предпочтительное лигирование ДНК-лигазой для сопоставления последовательностей приводит к сигналу, информативному о нуклеотиде в этом положении. Каждая база в шаблоне дважды упорядочивается, и полученные данные декодируются в соответствии со схемой кодирования с двумя базами , используемой в этом методе. Перед секвенированием ДНК амплифицируют с помощью эмульсионной ПЦР. Полученные шарики, каждая из которых содержит отдельные копии одной и той же молекулы ДНК, наносят на предметное стекло. [108] Результатом являются последовательности количества и длины, сравнимые с секвенированием Illumina. [72] Сообщалось, что это секвенирование методом лигирования имеет некоторые проблемы с секвенированием палиндромных последовательностей. [91]
Секвенирование полупроводников Ion Torrent
Компания Ion Torrent Systems Inc. (теперь принадлежит Life Technologies ) разработала систему, основанную на использовании стандартной химии секвенирования, но с новой системой обнаружения на основе полупроводников. Этот метод секвенирования основан на обнаружении ионов водорода , которые выделяются во время полимеризации в ДНК , в отличие от оптических методов , используемых в других системах секвенирования. Микролунка, содержащая цепь ДНК-матрицы, подлежащую секвенированию, заполняется нуклеотидом одного типа . Если введенный нуклеотид комплементарен ведущему нуклеотиду-матрице, он включается в растущую комплементарную цепь. Это вызывает высвобождение иона водорода, который запускает сверхчувствительный ионный датчик, что указывает на то, что произошла реакция. Если в матричной последовательности присутствуют гомополимерные повторы, несколько нуклеотидов будут включены в один цикл. Это приводит к соответствующему количеству высвобождаемых водородов и пропорционально более высокому электронному сигналу. [109]
Секвенирование наношаров ДНК
Секвенирование наношаров ДНК - это тип высокопроизводительной технологии секвенирования, используемой для определения всей геномной последовательности организма. Компания Complete Genomics использует эту технологию для секвенирования образцов, представленных независимыми исследователями. В этом методе используется репликация по вращающемуся кругу для амплификации небольших фрагментов геномной ДНК в наношарики ДНК. Затем для определения нуклеотидной последовательности используется свободное секвенирование путем лигирования. [110] Этот метод секвенирования ДНК позволяет большое количество ДНК nanoballs быть секвенировано в перспективу и при низких реагентных затратах по сравнению с другими высокими пропускной секвенированией платформ. [111] Однако только короткие последовательности ДНК определяются из каждого наношара ДНК, что затрудняет сопоставление коротких считываний с эталонным геномом . [110] Эта технология использовалась для нескольких проектов по секвенированию генома, и ее планируется использовать в других целях. [112]
Секвенирование одной молекулы с помощью Heliscope
Секвенирование Heliscope - это метод секвенирования одной молекулы, разработанный Helicos Biosciences . Он использует фрагменты ДНК с добавленными адаптерами хвоста поли-А, которые прикреплены к поверхности проточной ячейки. Следующие шаги включают основанное на расширении секвенирование с циклической промывкой проточной кюветы флуоресцентно меченными нуклеотидами (по одному типу нуклеотидов за раз, как в методе Сэнгера). Чтения выполняются секвенсором Heliscope. [113] [114] Чтения короткие, в среднем 35 п.н. [115] Что сделало эту технологию особенно новой, так это то, что она была первой в своем классе, которая секвенировала неамплифицированную ДНК, тем самым предотвращая любые ошибки чтения, связанные с этапами амплификации. [116] В 2009 году геном человека был секвенирован с помощью Heliscope, однако в 2012 году компания обанкротилась. [117]
Микрожидкостные системы
Есть две основные микрофлюидные системы, которые используются для секвенирования ДНК; капельная микрофлюидика и цифровая микрофлюидика . Микрожидкостные устройства решают многие из текущих ограничений современных систем секвенирования.
Abate et al. изучал использование микрожидкостных устройств на основе капель для секвенирования ДНК. [4] Эти устройства способны формировать и обрабатывать капли размером с пиколитр со скоростью тысячи в секунду. Устройства были созданы из полидиметилсилоксана (PDMS) и использовали резонансный перенос энергии Форстера, анализ FRET для считывания последовательностей ДНК, заключенных в каплях. Каждая позиция в массиве проверена на конкретную 15-ю базовую последовательность. [4]
Fair et al. использовали цифровые микрофлюидные устройства для изучения пиросеквенирования ДНК . [118] Существенные преимущества включают портативность устройства, объем реагента, скорость анализа, возможности массового производства и высокую производительность. Это исследование предоставило доказательство концепции, показывающей, что цифровые устройства можно использовать для пиросеквенирования; исследование включало использование синтеза, который включает расширение ферментов и добавление меченых нуклеотидов. [118]
Boles et al. также изучал пиросеквенирование на цифровых микрофлюидных устройствах. [119] Они использовали электросмачивающее устройство для создания, смешивания и разделения капель. При секвенировании используется протокол с тремя ферментами и шаблоны ДНК, закрепленные магнитными шариками. Устройство было протестировано с использованием двух протоколов и показало 100% точность на основе необработанных уровней пирограммы. Преимущества этих цифровых микрофлюидных устройств включают размер, стоимость и достижимые уровни функциональной интеграции. [119]
Исследование секвенирования ДНК с использованием микрофлюидики также может быть применено к секвенированию РНК с использованием аналогичных методов капельной микрофлюидии, таких как метод inDrops. [120] Это показывает, что многие из этих методов секвенирования ДНК можно будет применять и дальше, чтобы лучше понять геномы и транскриптомы.
Методы в разработке
Методы секвенирования ДНК, которые в настоящее время разрабатываются, включают считывание последовательности по мере прохождения цепи ДНК через нанопоры (метод, который сейчас является коммерческим, но последующие поколения, такие как твердотельные нанопоры, все еще находятся в разработке) [121] [122] и методы, основанные на микроскопии. такие как атомно-силовая микроскопия или просвечивающая электронная микроскопия , которые используются для определения положений отдельных нуклеотидов в длинных фрагментах ДНК (> 5000 п.н.) путем маркировки нуклеотидов более тяжелыми элементами (например, галогенами) для визуального обнаружения и записи. [123] [124] Технологии третьего поколения направлены на повышение производительности и сокращение времени получения результата и стоимости за счет устранения необходимости в избыточных реагентах и использования процессивности ДНК-полимеразы. [125]
Туннельные токи Секвенирование ДНК
Другой подход использует измерения электрических туннельных токов через однонитевую ДНК, когда она движется по каналу. В зависимости от своей электронной структуры каждая база по-разному влияет на туннельный ток [126], что позволяет различать разные базы. [127]
Использование туннельных токов может обеспечить последовательность на порядки быстрее, чем методы ионного тока, и уже достигнуто секвенирование нескольких олигомеров ДНК и микро-РНК. [128]
Секвенирование путем гибридизации
Секвенирование путем гибридизации - неферментативный метод, в котором используется ДНК-микрочип . Единый пул ДНК, последовательность которого должна быть определена, флуоресцентно метят и гибридизуют с массивом, содержащим известные последовательности. Сильные сигналы гибридизации от данного пятна на массиве идентифицируют его последовательность в секвенируемой ДНК. [129]
Этот метод секвенирования использует характеристики связывания библиотеки коротких одноцепочечных молекул ДНК (олигонуклеотидов), также называемых ДНК-зондами, для реконструкции целевой последовательности ДНК. Неспецифические гибриды удаляют промыванием и элюируют ДНК-мишень. [130] Гибриды перестраиваются таким образом, что последовательность ДНК может быть реконструирована. Преимущество этого типа секвенирования заключается в его способности захватывать большое количество целей с однородным покрытием. [131] Обычно требуется большое количество химикатов и исходная ДНК. Однако с появлением гибридизации на основе растворов требуется гораздо меньше оборудования и химикатов. [130]
Секвенирование с масс-спектрометрией
Для определения последовательностей ДНК можно использовать масс-спектрометрию . Матричная лазерная десорбционная ионизационная времяпролетная масс-спектрометрия, или MALDI-TOF MS , была специально исследована как альтернативный метод гель-электрофорезу для визуализации фрагментов ДНК. С помощью этого метода фрагменты ДНК, полученные в результате реакций секвенирования с обрывом цепи, сравнивают по массе, а не по размеру. Масса каждого нуклеотида отличается от массы других, и эту разницу можно обнаружить с помощью масс-спектрометрии. Однонуклеотидные мутации во фрагменте легче обнаружить с помощью МС, чем с помощью только гель-электрофореза. MALDI-TOF MS может более легко обнаруживать различия между фрагментами РНК, поэтому исследователи могут косвенно секвенировать ДНК с помощью методов на основе MS, сначала преобразовав ее в РНК. [132]
Более высокое разрешение фрагментов ДНК, разрешенное методами на основе МС, представляет особый интерес для исследователей судебной медицины, поскольку они могут захотеть найти однонуклеотидные полиморфизмы в образцах ДНК человека для идентификации людей. Эти образцы могут быть сильно разложены, поэтому судебно-медицинские эксперты часто предпочитают митохондриальную ДНК из- за ее более высокой стабильности и применения в исследованиях клонов. Методы секвенирования MS на основе были использованы для сравнения последовательностей митохондриальной ДНК человека из образцов в Федеральном бюро расследований базы данных [133] и из костей найдены в массовых могилах солдат Первой мировой войны. [134]
Методы раннего завершения цепи и TOF MS продемонстрировали длину считывания до 100 пар оснований. [135] Исследователи не смогли превысить этот средний размер чтения; подобно секвенированию только по окончанию цепи, секвенирование ДНК на основе МС может не подходить для крупных проектов по секвенированию de novo . Тем не менее, недавнее исследование действительно использовало считывание коротких последовательностей и масс-спектроскопию для сравнения однонуклеотидных полиморфизмов в патогенных штаммах Streptococcus . [136]
Микрожидкостное секвенирование по Сэнгеру
При микрофлюидном секвенировании по Сэнгеру вся амплификация фрагментов ДНК с помощью термоциклирования, а также их разделение с помощью электрофореза выполняется на одной стеклянной пластине (приблизительно 10 см в диаметре), что сокращает использование реагентов, а также стоимость. [137] В некоторых случаях исследователи показали, что они могут увеличить производительность обычного секвенирования с помощью микрочипов. [138] Еще предстоит провести исследования, чтобы сделать такое использование технологий эффективным.
Методы, основанные на микроскопии
Этот подход позволяет непосредственно визуализировать последовательность молекул ДНК с помощью электронной микроскопии. Первая идентификация пар оснований ДНК в интактных молекулах ДНК путем ферментативного включения модифицированных оснований, которые содержат атомы с увеличенным атомным номером, прямой визуализации и идентификации индивидуально помеченных оснований в синтетической молекуле ДНК с 3272 парами оснований и вирусном геноме с 7249 парами оснований. было продемонстрировано. [139]
Секвенирование RNAP
Этот метод основан на использовании РНК-полимеразы (РНКП), которая прикрепляется к шарику из полистирола . Один конец ДНК, подлежащий секвенированию, прикрепляют к другой бусине, причем обе бусинки помещают в оптические ловушки. Движение RNAP во время транскрипции сближает шарики, и их относительное расстояние изменяется, что затем может быть записано с разрешением в один нуклеотид. Последовательность выводится на основе четырех считываний с пониженными концентрациями каждого из четырех типов нуклеотидов, аналогично методу Сэнгера. [140] Сравнение проводится между областями, и информация о последовательности выводится путем сравнения областей известной последовательности с областями неизвестной последовательности. [141]
Высокопроизводительное секвенирование вирусов in vitro
Был разработан метод анализа полных наборов взаимодействий белков с использованием комбинации 454 пиросеквенирования и метода отображения мРНК вируса in vitro . В частности, этот метод ковалентно связывает интересующие белки с кодирующими их мРНК, а затем обнаруживает фрагменты мРНК с помощью ПЦР с обратной транскрипцией . Затем мРНК можно амплифицировать и секвенировать. Комбинированный метод получил название IVV-HiTSeq и может выполняться в бесклеточных условиях, хотя его результаты могут не соответствовать условиям in vivo . [142]
Базовые приготовления
Успех любого протокола секвенирования ДНК зависит от экстракции и подготовки образца ДНК или РНК из интересующего биологического материала.
- В результате успешной экстракции ДНК будет получен образец ДНК с длинными неразрушенными цепями.
- Успешная экстракция РНК даст образец РНК, который необходимо преобразовать в комплементарную ДНК (кДНК) с использованием обратной транскриптазы - ДНК-полимеразы, которая синтезирует комплементарную ДНК на основе существующих цепей РНК способом, подобным ПЦР. [143] Комплементарную ДНК затем можно обрабатывать так же, как геномную ДНК.
В соответствии с используемой технологией секвенирования образцы, полученные в результате экстракции ДНК или РНК, требуют дополнительной подготовки. Для секвенирования по Сэнгеру перед секвенированием требуются либо процедуры клонирования, либо ПЦР. В случае методов секвенирования следующего поколения перед обработкой требуется подготовка библиотеки. [144] Оценка качества и количества нуклеиновых кислот как после экстракции, так и после подготовки библиотеки выявляет деградированные, фрагментированные и низкочистые образцы и дает высококачественные данные секвенирования. [145]
Высокопроизводительный характер современных технологий секвенирования ДНК / РНК поставил проблему для масштабирования метода подготовки проб. Несколько инструментов для работы с жидкостями используются для подготовки большего количества проб с меньшим общим временем работы:
Компания | Погрузчики жидкости / Автоматизация | lower_mark_USD | upper_mark_USD | Landing_url |
Опентроны | ОпенТронс ОТ-2 | 5750 долл. США | 20 000 долл. США | https://www.opentrons.com/ |
Gilson | Гилсон Пипетмакс | 20 000 долл. США | 40 000 долл. США | https://gb.gilson.com/GBSV/system-pipetmax.html |
Neotec | Neotec EzMate | 25 000 долл. США | 45 000 долл. США | http://neotec.co.il/pipetting-device/ |
Formulatrix | Formulatrix Mantis | 40 000 долл. США | 60 000 долл. США | https://formulatrix.com/liquid-handling-systems/mantis-liquid-handler/ |
Hudson Robotics | Hudson Robotics СОЛО | 40 000 долл. США | 50 000 долл. США | https://hudsonrobotics.com/products/applications/automated-solutions-next-generation-sequencing-ngs/ |
Гамильтон | Гамильтон Микролаб НИМБУС | 40 000 долл. США | 80 000 долл. США | https://www.hamiltoncompany.com/automated-liquid-handling/platforms/microlab-nimbus#specifications |
TTP Labtech | TTP Labtech Mosquito HV Genomics | 45 000 долл. США | 80 000 долл. США | https://www.sptlabtech.com/products/liquid-handling/mosquito-hv-genomics/ |
Бекман Коултер | Биомек 4000 | 50 000 долл. США | 65 000 долл. США | https://www.mybeckman.uk/liquid-handlers/biomek-4000/b22640 |
Гамильтон | Гамильтон Геномик STARlet | 50 000 долл. США | 100 000 долл. США | https://www.hamiltoncompany.com/automated-liquid-handling/assay-ready-workstations/genomic-starlet |
Eppendorf | Eppendorf epMotion 5075t | 95 000 долл. США | 110 000 долл. США | https://www.eppendorf.com/epmotion/ |
Бекман Коултер | Beckman Coulter Biomek i5 | 100 000 долл. США | 150 000 долл. США | https://www.beckman.com/liquid-handlers/biomek-i5 |
Гамильтон | Гамильтон NGS STAR | 100 000 долл. США | 200 000 долл. США | http://www.hamiltonrobotics.com/ |
ПеркинЭлмер | PerkinElmer Sciclone G3 NGS и рабочая станция NGSx | 150 000 долл. США | 220 000 долл. США | https://www.perkinelmer.com/uk/product/sciclone-g3-ngs-workstation-cls145321 |
Agilent | Agilent Bravo NGS | 170 000 долл. США | 290 000 долл. США | https://www.agilent.com/en/products/automated-liquid-handling/automated-liquid-handling-applications/bravo-ngs |
Бекман Коултер | Beckman Coulter Biomek i7 | 200 000 долл. США | 250 000 долл. США | https://www.beckman.com/liquid-handlers/biomek-i7 |
Лабцит Эхо 525 | Beckman Coulter Labcyte Echo 525 | 260 000 долл. США | 300 000 долл. США | https://www.labcyte.com/products/liquid-handling/echo-525-liquid-handler |
Tecan | Tecan NGS | 270 000 долл. США | 350 000 долл. США | https://lifesciences.tecan.com/ngs-sample-preparation |
Инициативы развития
В октябре 2006 года фонд X Prize Foundation выступил с инициативой по содействию развитию технологий полногеномного секвенирования , получившей название Archon X Prize , с намерением выделить 10 миллионов долларов «первой команде, которая сможет создать устройство и использовать его для секвенирования 100 геномов человека. в течение 10 дней или меньше, с точностью не более одной ошибки на каждые 100 000 секвенированных оснований, с последовательностями, точно покрывающими не менее 98% генома, и с повторяющейся стоимостью не более 10 000 долларов США за геном ". [146]
Каждый год Национальный институт исследования генома человека (NHGRI) выделяет гранты на новые исследования и разработки в области геномики . Гранты 2010 года и кандидаты 2011 года включают продолжение работы в области микрожидкостных, полониевых и основных методик секвенирования. [147]
Вычислительные проблемы
Описанные здесь технологии секвенирования производят необработанные данные, которые необходимо собрать в более длинные последовательности, такие как полные геномы ( сборка последовательностей ). Для достижения этого существует множество вычислительных задач, таких как оценка необработанных данных последовательности, которая выполняется программами и алгоритмами, такими как Phred и Phrap . Другие проблемы связаны с повторяющимися последовательностями, которые часто препятствуют полной сборке генома, потому что они встречаются во многих местах генома. Как следствие, многие последовательности не могут быть отнесены к конкретным хромосомам . Получение исходных данных о последовательностях - это только начало их подробного биоинформатического анализа. [148] Тем не менее, были разработаны новые методы секвенирования и исправления ошибок секвенирования. [149]
Читать обрезку
Иногда необработанные считывания, производимые секвенсором, являются правильными и точными только в части их длины. Использование всего чтения может привести к появлению артефактов в последующих анализах, таких как сборка генома, вызов snp или оценка экспрессии генов. Были введены два класса программ обрезки, основанные на классах алгоритмов, основанных на окнах или на классах алгоритмов с промежуточной суммой. [150] Это неполный список алгоритмов обрезки, доступных в настоящее время, с указанием класса алгоритмов, к которому они принадлежат:
Название алгоритма | Тип алгоритма | Ссылка на сайт |
---|---|---|
Cutadapt [151] | Текущая сумма | Cutadapt |
ConDeTri [152] | На основе окна | ConDeTri |
ЭРНЕ-ФИЛЬТР [153] | Текущая сумма | ERNE-ФИЛЬТР |
Качественный триммер FASTX | На основе окна | Качественный триммер FASTX |
PRINSEQ [154] | На основе окна | PRINSEQ |
Trimmomatic [155] | На основе окна | Trimmomatic |
SolexaQA [156] | На основе окна | SolexaQA |
SolexaQA-BWA | Текущая сумма | SolexaQA-BWA |
Серп | На основе окна | Серп |
Этические вопросы
Генетика человека была включена в сферу биоэтики с начала 1970-х годов [157], и рост использования секвенирования ДНК (особенно высокопроизводительного секвенирования) привел к возникновению ряда этических проблем. Одна из ключевых проблем - это право собственности на ДНК человека и данные, полученные при секвенировании этой ДНК. [158] Что касается самой молекулы ДНК, главного судебного дела по этой теме, Мур против Регентов Калифорнийского университета (1990) постановил, что отдельные лица не имеют прав собственности на выброшенные клетки или какую-либо прибыль, полученную с использованием этих клеток (например, как запатентованная клеточная линия ). Однако люди имеют право на информированное согласие на удаление и использование ячеек. Что касается данных, полученных с помощью секвенирования ДНК, Мур не дает человеку никаких прав на информацию, полученную из его ДНК. [158]
По мере того как секвенирование ДНК становится все более распространенным, хранение, безопасность и совместное использование геномных данных также становятся все более важными. [158] [159] Например, одна проблема заключается в том, что страховщики могут использовать геномные данные человека для изменения своей квоты, в зависимости от предполагаемого будущего здоровья человека на основе его ДНК. [159] [160] В мае 2008 года в США был подписан Закон о недискриминации в отношении генетической информации (GINA), запрещающий дискриминацию на основе генетической информации в отношении медицинского страхования и трудоустройства. [161] [162] В 2012 году Комиссия при президенте США по изучению биоэтических проблем сообщила, что существующее законодательство о конфиденциальности для данных секвенирования ДНК, таких как GINA и Закон о переносимости и подотчетности медицинского страхования, является недостаточным, отметив, что данные секвенирования всего генома особенно чувствительный, так как его можно использовать для идентификации не только человека, от которого были созданы данные, но и его родственников. [163] [164]
В большинстве Соединенных Штатов «брошенная» ДНК, например ДНК, обнаруженная на облизанной марке или конверте, кофейной чашке, сигарете, жевательной резинке, бытовом мусоре или волосах, упавших на общественный тротуар, может быть законно собрана. и определен кем угодно, включая полицию, частных детективов, политических оппонентов или людей, участвующих в спорах об отцовстве. По состоянию на 2013 год в одиннадцати штатах действуют законы, запрещающие «кражу ДНК». [165]
Этические проблемы также были подняты в связи с все более широким использованием скрининга генетических вариаций как у новорожденных, так и у взрослых такими компаниями, как 23andMe . [166] [167] Утверждалось, что скрининг на генетические вариации может быть вредным, увеличивая тревогу у людей, у которых был обнаружен повышенный риск заболевания. [168] Например, в одном случае, упомянутом в Time , врачи, проверяющие больного ребенка на генетические варианты, предпочли не сообщать родителям о неродственном варианте, связанном с деменцией, из-за вреда, который он может причинить родителям. [169] Тем не менее, исследование 2011 года, опубликованное в Медицинском журнале Новой Англии , показало, что люди, подвергавшиеся анализу риска заболеваний, не проявляли повышенного уровня беспокойства. [168]
Смотрите также
|
|
Заметки
- ^ «Следующее поколение» остается широко используемым с 2019 года. Например, Straiton J, Free T, Sawyer A, Martin J (февраль 2019). «От секвенирования по Сэнгеру к базам данных генома и не только» . Биотехнологии . 66 (2): 60–63. DOI : 10.2144 / БТН-2019-0011 . PMID 30744413 .
Технологии секвенирования нового поколения (NGS) произвели революцию в геномных исследованиях. (вступительное предложение статьи)
Рекомендации
- ^ «Представляем« темную ДНК »- явление, которое может изменить наши представления об эволюции» .
- ^ Бехджати С., Тарпей П.С. (декабрь 2013 г.). "Что такое секвенирование следующего поколения?" . Архив болезней детства. Выпуск "Образование и практика" . 98 (6): 236–8. DOI : 10.1136 / archdischild-2013-304340 . PMC 3841808 . PMID 23986538 .
- ^ Хмелецкий Дж., Мейерсон М. (14 января 2014 г.). «Секвенирование ДНК рака: что мы узнали?». Ежегодный обзор медицины . 65 (1): 63–79. DOI : 10.1146 / annurev-med-060712-200152 . PMID 24274178 .
- ^ а б в г Абате А.Р., Хунг Т., Сперлинг Р.А., Мэри П., Ротем А., Агрести Дж. Дж. И др. (Декабрь 2013). «Анализ последовательности ДНК с помощью капельной микрофлюидики» . Лаборатория на чипе . 13 (24): 4864–9. DOI : 10.1039 / c3lc50905b . PMC 4090915 . PMID 24185402 .
- ^ Пекин Д., Схири Ю., Барет Дж. К., Ле Корре Д., Мазутис Л., Салем С. Б. и др. (Июль 2011 г.). «Количественное и чувствительное обнаружение редких мутаций с использованием капельной микрофлюидики». Лаборатория на чипе . 11 (13): 2156–66. DOI : 10.1039 / c1lc20128j . PMID 21594292 .
- ^ Ольсвик О., Уолберг Дж., Петтерсон Б., Улен М., Попович Т., Ваксмут И.К., Филдс П.И. (январь 1993 г.). «Использование автоматического секвенирования ампликонов, созданных полимеразной цепной реакцией, для идентификации трех типов субъединицы В холерного токсина в штаммах Vibrio cholerae O1» . J. Clin. Microbiol. 31 (1): 22–25. DOI : 10.1128 / JCM.31.1.22-25.1993 . PMC 262614 . PMID 7678018 .
- ^ Петтерссон Э., Лундеберг Дж., Ахмадиан А. (февраль 2009 г.). «Поколения технологий секвенирования». Геномика . 93 (2): 105–11. DOI : 10.1016 / j.ygeno.2008.10.003 . PMID 18992322 .
- ^ Хант, Кэти (17 февраля 2021 г.). «Самая старая ДНК в мире, полученная от мамонта, жившего более миллиона лет назад» . Новости CNN . Проверено 17 февраля 2021 года .
- ^ Каллавей, Юэн (17 февраля 2021 г.). «Геном мамонта, которому миллион лет, бьет рекорды по старейшей древней ДНК - сохранившиеся в вечной мерзлоте зубы возрастом до 1,6 миллиона лет позволяют идентифицировать новый вид мамонта в Сибири» . Природа . 590 (7847): 537–538. DOI : 10.1038 / d41586-021-00436-х . PMID 33597786 . Проверено 17 февраля 2021 года .
- ^ а б в Кастро, Кристина; Марин, Рэйчел; Рамос, Эдвард; Нг, Терри Фей Фан (2019). «Влияние вариантной интерференции на сборку de novo для глубокого секвенирования вирусов» . BMC Genomics . 21 (1): 421. bioRxiv 10.1101 / 815480 . DOI : 10,1186 / s12864-020-06801-ш . PMC 7306937 . PMID 32571214 .
- ^ а б Воль, Ширли; Шаффнер, Стивен Ф .; Сабети, Пардис К. (2016). «Геномный анализ вирусных вспышек» . Ежегодный обзор вирусологии . 3 (1): 173–195. DOI : 10.1146 / annurev-virology-110615-035747 . PMC 5210220 . PMID 27501264 .
- ^ Schleusener V, Köser CU, Beckert P, Niemann S, Feuerriegel S (2017). « Прогнозирование устойчивости Mycobacterium tuberculosis и классификация клонов на основе секвенирования генома: сравнение инструментов автоматизированного анализа» . Sci Rep . 7 : 46327. Bibcode : 2017NatSR ... 746327S . DOI : 10.1038 / srep46327 . PMC 7365310 . PMID 28425484 .
- ^ Маэ П., Эль-Азами М., Барлас П., Турно М. (2019). «Крупномасштабная оценка TBProfiler и Mykrobe для прогнозирования устойчивости Mycobacterium tuberculosis к антибиотикам » . PeerJ . 7 : e6857. DOI : 10,7717 / peerj.6857 . PMC 6500375 . PMID 31106066 .
- ^ Mykrobe predictor - прогнозирование устойчивости к антибиотикам для S. aureus и M. tuberculosis на основе данных последовательности всего генома
- ^ Быстрые прогнозы устойчивости к антибиотикам на основе данных последовательности генома для Staphylococcus aureus и Mycobacterium tuberculosis
- ^ «Майкл Мосли против супербактерий» . Архивировано из оригинального 24 ноября 2020 года . Проверено 21 октября 2019 года .
- ^ Mykrobe Predictor github
- ^ Кертис С., Херевард Дж. (29 августа 2017 г.). «От места преступления до зала суда: путешествие образца ДНК» . Разговор .
- ^ Морера С., Ларивьер Л., Курцек Дж., Ашке-Зонненборн Ю., Фримонт П.С., Джанин Дж., Рюгер В. (август 2001 г.). «Кристаллические структуры с высоким разрешением бета-глюкозилтрансферазы фага Т4: индуцированная подгонка и эффект связывания субстрата и металла». Журнал молекулярной биологии . 311 (3): 569–77. DOI : 10.1006 / jmbi.2001.4905 . PMID 11493010 .
- ^ Эрлих М., Гама-Соса М.А., Хуанг Л.Х., Миджетт Р.М., Куо К.С., МакКьюн Р.А., Герке С. (апрель 1982 г.). «Количество и распределение 5-метилцитозина в ДНК человека из различных типов тканей клеток» . Исследования нуклеиновых кислот . 10 (8): 2709–21. DOI : 10.1093 / NAR / 10.8.2709 . PMC 320645 . PMID 7079182 .
- ^ Эрлих М., Ван Р. Я. (июнь 1981 г.). «5-Метилцитозин в эукариотической ДНК». Наука . 212 (4501): 1350–7. Bibcode : 1981Sci ... 212.1350E . DOI : 10.1126 / science.6262918 . PMID 6262918 .
- ^ Song CX, Clark TA, Lu XY, Kislyuk A, Dai Q, Turner SW и др. (Ноябрь 2011 г.). «Чувствительное и специфическое секвенирование одной молекулы 5-гидроксиметилцитозина» . Методы природы . 9 (1): 75–7. DOI : 10.1038 / nmeth.1779 . PMC 3646335 . PMID 22101853 .
- ^ Уотсон Дж. Д., Крик Ф. Х. (1953). «Строение ДНК». Харб Холодного источника. Symp. Quant. Биол . 18 : 123–31. DOI : 10.1101 / SQB.1953.018.01.020 . PMID 13168976 .
- ^ Маркс, L, Путь к секвенированию ДНК: жизнь и работа Фредерика Сэнгера .
- ^ Мин Джоу В., Хэгеман Г., Исебаерт М., Фирс В. (май 1972 г.). «Нуклеотидная последовательность гена, кодирующего белок оболочки бактериофага MS2». Природа . 237 (5350): 82–8. Bibcode : 1972Natur.237 ... 82J . DOI : 10.1038 / 237082a0 . PMID 4555447 . S2CID 4153893 .
- ^ Фирс В., Контрерас Р., Дуэринк Ф., Хэгеман Дж., Изерентант Д., Меррегерт Дж., Мин Джоу В., Молеманс Ф., Рэймакерс А., Ван ден Берге А., Фолькаерт Дж., Исебаерт М. (апрель 1976 г.). «Полная нуклеотидная последовательность РНК бактериофага MS2: первичная и вторичная структура гена репликазы». Природа . 260 (5551): 500–7. Bibcode : 1976Natur.260..500F . DOI : 10.1038 / 260500a0 . PMID 1264203 . S2CID 4289674 .
- ^ Озсолак Ф., Милош П.М. (февраль 2011 г.). «Секвенирование РНК: достижения, проблемы и возможности» . Природа Обзоры Генетики . 12 (2): 87–98. DOI : 10.1038 / nrg2934 . PMC 3031867 . PMID 21191423 .
- ^ «Профиль факультета Рэй Ву» . Cornell University. Архивировано из оригинала 4 марта 2009 года.
- ^ Падманабхан Р., Джей Э., Ву Р. (июнь 1974 г.). «Химический синтез праймера и его использование в анализе последовательности гена лизоцима бактериофага Т4» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 71 (6): 2510–4. Bibcode : 1974PNAS ... 71.2510P . DOI : 10.1073 / pnas.71.6.2510 . PMC 388489 . PMID 4526223 .
- ^ Онага Л.А. (июнь 2014 г.). «Рэй Ву как пятый бизнес: демонстрация коллективной памяти в истории секвенирования ДНК». Исследования по истории и философии науки . Часть C. 46 : 1–14. DOI : 10.1016 / j.shpsc.2013.12.006 . PMID 24565976 .
- ^ Ву Р. (1972). «Анализ нуклеотидной последовательности ДНК». Природа Новая Биология . 236 (68): 198–200. DOI : 10.1038 / newbio236198a0 . PMID 4553110 .
- ^ Падманабхан Р., Ву Р. (1972). «Анализ нуклеотидной последовательности ДНК. IX. Использование олигонуклеотидов определенной последовательности в качестве праймеров в анализе последовательности ДНК». Биохим. Биофиз. Res. Commun . 48 (5): 1295–302. DOI : 10.1016 / 0006-291X (72) 90852-2 . PMID 4560009 .
- ^ Wu R, Tu CD, Padmanabhan R (1973). «Анализ нуклеотидной последовательности ДНК. XII. Химический синтез и анализ последовательности додекадеоксинуклеотида, который связывается с геном эндолизина бактериофага лямбда». Биохим. Биофиз. Res. Commun . 55 (4): 1092–99. DOI : 10.1016 / S0006-291X (73) 80007-5 . PMID 4358929 .
- ^ Джей Э., Бамбара Р., Падманабхан Р., Ву Р. (март 1974 г.). «Анализ последовательности ДНК: общий, простой и быстрый метод секвенирования больших олигодезоксирибонуклеотидных фрагментов путем картирования» . Исследования нуклеиновых кислот . 1 (3): 331–53. DOI : 10.1093 / NAR / 1.3.331 . PMC 344020 . PMID 10793670 .
- ^ а б Сэнгер Ф, Никлен С, Колсон А.Р. (декабрь 1977 г.). «Секвенирование ДНК с помощью ингибиторов обрыва цепи» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 74 (12): 5463–77. Bibcode : 1977PNAS ... 74.5463S . DOI : 10.1073 / pnas.74.12.5463 . PMC 431765 . PMID 271968 .
- ^ а б в Максам А.М., Гилберт В. (февраль 1977 г.). «Новый метод секвенирования ДНК» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 74 (2): 560–64. Bibcode : 1977PNAS ... 74..560M . DOI : 10.1073 / pnas.74.2.560 . PMC 392330 . PMID 265521 .
- ^ Гилберт, W. Секвенирование ДНК и структура гена . Нобелевская лекция, 8 декабря 1980 г.
- ^ Гилберт В., Максам А. (декабрь 1973 г.). «Нуклеотидная последовательность оператора lac» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 70 (12): 3581–84. Bibcode : 1973PNAS ... 70.3581G . DOI : 10.1073 / pnas.70.12.3581 . PMC 427284 . PMID 4587255 .
- ^ Сэнгер Ф., Air GM, Баррелл Б.Г., Браун Н.Л., Колсон А.Р., Фиддес, Калифорния, Хатчисон, Калифорния, Слокомб П.М., Смит М. (февраль 1977 г.). «Нуклеотидная последовательность ДНК бактериофага phi X174». Природа . 265 (5596): 687–95. Bibcode : 1977Natur.265..687S . DOI : 10.1038 / 265687a0 . PMID 870828 . S2CID 4206886 .
- ^ "The Next Frontier: Human Viruses" , whatisbiotechnology.org, дата обращения 3 мая 2017 г.
- ^ Бек С., Поль FM (1984). «Секвенирование ДНК с помощью прямого блоттингового электрофореза» . EMBO J . 3 (12): 2905–09. DOI : 10.1002 / j.1460-2075.1984.tb02230.x . PMC 557787 . PMID 6396083 .
- ^ Патент США 4631122 (1986)
- ^ Feldmann H, et al. (1994). «Полная последовательность ДНК хромосомы II дрожжей» . EMBO J . 13 (24): 5795–809. DOI : 10.1002 / j.1460-2075.1994.tb06923.x . PMC 395553 . PMID 7813418 .
- ^ Смит Л. М., Сандерс Дж. З., Кайзер Р. Дж., Хьюз П., Додд С., Коннелл С. Р., Хайнер С., Кент С. Б., Худ Л. Е. (12 июня 1986 г.). «Обнаружение флуоресценции в автоматическом анализе последовательностей ДНК». Природа . 321 (6071): 674–79. Bibcode : 1986Natur.321..674S . DOI : 10.1038 / 321674a0 . PMID 3713851 . S2CID 27800972 .
- ^ Пробер Дж. М., Трейнор Г. Л., Дам Р. Дж., Хоббс Ф. У., Робертсон К. В., Загурски Р. Дж., Кокуцца А. Дж., Дженсен М. А., Баумейстер К. (16 октября 1987 г.). «Система для быстрого секвенирования ДНК с флуоресцентными дидезоксинуклеотидами, завершающими цепь». Наука . 238 (4825): 336–41. Bibcode : 1987Sci ... 238..336P . DOI : 10.1126 / science.2443975 . PMID 2443975 .
- ^ Adams MD, Kelley JM, Gocayne JD, Dubnick M, Polymeropoulos MH, Xiao H, Merril CR, Wu A, Olde B, Moreno RF (июнь 1991). «Комплементарное секвенирование ДНК: метки экспрессированной последовательности и проект генома человека». Наука . 252 (5013): 1651–56. Bibcode : 1991Sci ... 252.1651A . DOI : 10.1126 / science.2047873 . PMID 2047873 . S2CID 13436211 .
- ^ Флейшманн Р.Д., Адамс, доктор медицины, Уайт О., Клейтон Р.А., Киркнесс Э.Ф., Керлаваж А.Р., Булт С.Дж., Могила Д.Ф., Догерти Б.А., Меррик Дж.М. (июль 1995 г.) «Полное геномное случайное секвенирование и сборка Haemophilus influenzae Rd ». Наука . 269 (5223): 496–512. Bibcode : 1995Sci ... 269..496F . DOI : 10.1126 / science.7542800 . PMID 7542800 .
- ^ Lander ES, Linton LM, Birren B, Nusbaum C, Zody MC и др. (Февраль 2001 г.). «Первоначальное секвенирование и анализ генома человека» (PDF) . Природа . 409 (6822): 860–921. Bibcode : 2001Natur.409..860L . DOI : 10.1038 / 35057062 . PMID 11237011 .
- ^ Вентер Дж. К., Адамс М. Д. и др. (Февраль 2001 г.). «Последовательность генома человека» . Наука . 291 (5507): 1304–51. Bibcode : 2001Sci ... 291.1304V . DOI : 10.1126 / science.1058040 . PMID 11181995 .
- ^ Ян, Аймин; Чжан, Вэй; Ван, Цзяхао; Ян, Кэ; Хан, Ян; Чжан, Лимин (2020). «Обзор применения алгоритмов машинного обучения в анализе данных последовательностей ДНК» . Границы биоинженерии и биотехнологии . 8 : 1032. DOI : 10.3389 / fbioe.2020.01032 . PMC 7498545 . PMID 33015010 .
- ^ «Эспаснет - Библиографические данные» . world.espacenet.com .
- ^ Ронаги М., Карамохамед С., Петтерссон Б., Улен М., Нирен П. (1996). «Секвенирование ДНК в реальном времени с использованием обнаружения высвобождения пирофосфата». Аналитическая биохимия . 242 (1): 84–89. DOI : 10.1006 / abio.1996.0432 . PMID 8923969 .
- ^ а б Кавасима, Эрик Х .; Лоран Фаринелли; Паскаль Майер (12 мая 2005 г.). «Патент: Метод амплификации нуклеиновых кислот» . Архивировано из оригинального 22 февраля 2013 года . Проверено 22 декабря 2012 года .
- ^ Юинг Б., Грин П. (март 1998 г.). «Базовый вызов трассировок автоматического секвенсора с использованием phred. II. Вероятности ошибок» . Genome Res . 8 (3): 186–94. DOI : 10.1101 / gr.8.3.186 . PMID 9521922 .
- ^ «Показатели качества для секвенирования следующего поколения» (PDF) . Иллюмина . 31 октября 2011 . Проверено 8 мая 2018 .
- ^ а б Бреннер С., Джонсон М., Бриджем Дж., Голда Дж., Ллойд Д.Х., Джонсон Д., Луо С., МакКарди С., Фой М., Эван М., Рот Р., Джордж Д., Элетр С., Альбрехт Дж., Вермаас Е., Уильямс С. Р., Мун К. , Burcham T, Pallas M, DuBridge RB, Kirchner J, Fearon K, Mao J, Corcoran K (2000). «Анализ экспрессии генов путем массового параллельного секвенирования сигнатур (MPSS) на массивах микрогранул». Природа Биотехнологии . 18 (6): 630–34. DOI : 10.1038 / 76469 . PMID 10835600 . S2CID 13884154 .
- ^ Сэнгер Ф., Колсон А.Р. (май 1975 г.). «Экспресс-метод определения последовательностей в ДНК путем примированного синтеза с ДНК-полимеразой». J. Mol. Биол . 94 (3): 441–48. DOI : 10.1016 / 0022-2836 (75) 90213-2 . PMID 1100841 .
- ^ Веттерстранд, Крис. «Затраты на секвенирование ДНК: данные программы NHGRI Genome Sequencing Program (GSP)» . Национальный институт исследования генома человека . Проверено 30 мая 2013 года .
- ^ Перепел М.А., Гу И, Свердлов Х, Мэйхо М. (2012). «Оценка и оптимизация препаративных полуавтоматических систем электрофореза для подготовки библиотеки Illumina». Электрофорез . 33 (23): 3521–28. DOI : 10.1002 / elps.201200128 . PMID 23147856 . S2CID 39818212 .
- ^ Duhaime MB, Deng L, Poulos BT, Sullivan MB (2012). «К количественной метагеномике диких вирусов и других образцов ДНК сверхнизкой концентрации: тщательная оценка и оптимизация метода амплификации линкера» . Environ. Microbiol . 14 (9): 2526–37. DOI : 10.1111 / j.1462-2920.2012.02791.x . PMC 3466414 . PMID 22713159 .
- ^ Петерсон Б.К., Вебер Дж. Н., Кей Э. Х., Фишер Х. С., Хэкстра Х. Э. (2012). «Двойной дайджест RADseq: недорогой метод обнаружения de novo SNP и генотипирования у модельных и немодельных видов» . PLOS ONE . 7 (5): e37135. Bibcode : 2012PLoSO ... 737135P . DOI : 10.1371 / journal.pone.0037135 . PMC 3365034 . PMID 22675423 .
- ^ Уильямс Р., Пейсайович С.Г., Миллер О.Дж., Магдасси С., Тауфик Д.С., Гриффитс А.Д. (2006). «Амплификация сложных библиотек генов методом эмульсионной ПЦР». Методы природы . 3 (7): 545–50. DOI : 10.1038 / nmeth896 . PMID 16791213 . S2CID 27459628 .
- ^ а б Маргулис М., Эгхолм М. и др. (Сентябрь 2005 г.). «Секвенирование генома в открытых микропроцессорных пиколитерных реакторах высокой плотности» . Природа . 437 (7057): 376–80. Bibcode : 2005Natur.437..376M . DOI : 10,1038 / природа03959 . PMC 1464427 . PMID 16056220 .
- ^ Шендуре Дж., Поррека Дж. Дж., Реппас Н. Б., Лин Х, МакКатчеон Дж. П., Розенбаум А. М., Ван М. Д., Чжан К., Митра Р. Д., Чёрч Г. М. (2005). «Точное мультиплексное секвенирование полонии развитого бактериального генома». Наука . 309 (5741): 1728–32. Bibcode : 2005Sci ... 309.1728S . DOI : 10.1126 / science.1117389 . PMID 16081699 . S2CID 11405973 .
- ^ «Прикладные биосистемы - файл не найден (ошибка 404)» . 16 мая 2008 года Архивировано из оригинала 16 мая 2008 года.
- ^ Гудвин С., Макферсон Дж. Д., Маккомби В. Р. (май 2016 г.). «Достигнув совершеннолетия: десять лет технологий секвенирования следующего поколения». Природа Обзоры Генетики . 17 (6): 333–51. DOI : 10.1038 / nrg.2016.49 . PMID 27184599 . S2CID 8295541 .
- ^ Staden R (11 июня 1979 г.). «Стратегия секвенирования ДНК с использованием компьютерных программ» . Исследования нуклеиновых кислот . 6 (7): 2601–10. DOI : 10.1093 / NAR / 6.7.2601 . PMC 327874 . PMID 461197 .
- ^ де Magalhães JP, Finch CE, Janssens G (2010). «Секвенирование следующего поколения в исследованиях старения: новые приложения, проблемы, подводные камни и возможные решения» . Обзоры исследований старения . 9 (3): 315–23. DOI : 10.1016 / j.arr.2009.10.006 . PMC 2878865 . PMID 19900591 .
- ^ Града А (август 2013 г.). «Секвенирование следующего поколения: методология и применение» . J Invest Dermatol . 133 (8): e11. DOI : 10.1038 / jid.2013.248 . PMID 23856935 .
- ^ Зал N (май 2007 г.). «Передовые технологии секвенирования и их более широкое влияние на микробиологию» . J. Exp. Биол. 210 (Pt 9): 1518–25. DOI : 10,1242 / jeb.001370 . PMID 17449817 .
- ^ Церковь GM (январь 2006 г.). «Геномы для всех». Sci. Являюсь. 294 (1): 46–54. Bibcode : 2006SciAm.294a..46C . DOI : 10.1038 / Scientificamerican0106-46 . PMID 16468433 .(требуется подписка)
- ^ а б в Schuster SC (январь 2008 г.). «Секвенирование следующего поколения меняет сегодняшнюю биологию». Nat. Методы . 5 (1): 16–18. DOI : 10.1038 / nmeth1156 . PMID 18165802 . S2CID 1465786 .
- ^ Кальб, Гилберт; Моксли, Роберт (1992). Массовые параллельные, оптические и нейронные вычисления в США . IOS Press . ISBN 978-90-5199-097-3.[ требуется страница ]
- ^ десять Bosch JR, Grody WW (2008). «Идти в ногу со следующим поколением» . Журнал молекулярной диагностики . 10 (6): 484–92. DOI : 10,2353 / jmoldx.2008.080027 . PMC 2570630 . PMID 18832462 .
- ^ Такер Т., Марра М., Фридман Дж. М. (2009). «Массивно параллельное секвенирование: следующая большая вещь в генетической медицине» . Американский журнал генетики человека . 85 (2): 142–54. DOI : 10.1016 / j.ajhg.2009.06.022 . PMC 2725244 . PMID 19679224 .
- ^ а б Стрэйтон Дж., Фри Т, Сойер А., Мартин Дж. (Февраль 2019 г.). «От секвенирования по Сэнгеру до баз данных генома и не только» . Биотехнологии . Будущее науки. 66 (2): 60–63. DOI : 10.2144 / БТН-2019-0011 . PMID 30744413 .
- ^ Квейл М.А., Смит М., Коупленд П., Отто Т.Д., Харрис С.Р., Коннор Т.Р., Бертони А., Свердлоу Х.П., Гу Y (1 января 2012 г.). «Рассказ о трех платформах секвенирования следующего поколения: сравнение секвенсоров Ion Torrent, Pacific Biosciences и illumina MiSeq» . BMC Genomics . 13 (1): 341. DOI : 10.1186 / 1471-2164-13-341 . PMC 3431227 . PMID 22827831 .
- ^ Лю Л., Ли И, Ли С., Ху Н, Хе И, Понг Р., Лин Д., Лу Л., Ло М. (1 января 2012 г.). «Сравнение систем секвенирования нового поколения» . Журнал биомедицины и биотехнологии . 2012 : 251364. дои : 10,1155 / 2012/251364 . PMC 3398667 . PMID 22829749 .
- ^ а б в «Новое программное обеспечение, полимераза для увеличения пропускной способности и доступности системы сиквелов - PacBio» . 7 марта 2018.
- ^ «После года тестирования два первых клиента PacBio ожидают более регулярного использования RS Sequencer в 2012 году» . GenomeWeb. 10 января 2012 г.( требуется регистрация )
- ^ Inc., Pacific Biosciences (2013). «Pacific Biosciences представляет новую химию с более длинными длинами считывания для обнаружения новых особенностей в последовательности ДНК и продвинутых исследований генома крупных организмов» .
- ^ Чин С.С., Александр Д.Х., Маркс П., Кламмер А.А., Дрейк Дж., Хайнер С., Клам А., Коупленд А., Хаддлстон Дж., Эйхлер Е.Э., Тернер С.В., Корлах Дж. (2013). «Негибридные, готовые сборки микробного генома на основе данных секвенирования SMRT с длинным считыванием». Nat. Методы . 10 (6): 563–69. DOI : 10.1038 / nmeth.2474 . PMID 23644548 . S2CID 205421576 .
- ^ а б "Сборка бактериального генома de novo: решенная проблема?" . 5 июля 2013 г.
- ^ Rasko DA, Webster DR, Sahl JW, Bashir A, Boisen N, Scheutz F, Paxinos EE, Sebra R, Chin CS, Iliopoulos D, Klammer A, Peluso P, Lee L, Kislyuk AO, Bullard J, Kasarskis A, Wang S. , Eid J, Rank D, Redman JC, Steyert SR, Frimodt-Møller J, Struve C, Petersen AM, Krogfelt KA, Nataro JP, Schadt EE, Waldor MK (25 августа 2011 г.). «Истоки штамма, вызвавшего вспышку гемолитико-уремического синдрома в Германии» . N Engl J Med . 365 (8): 709–17. DOI : 10.1056 / NEJMoa1106920 . PMC 3168948 . PMID 21793740 .
- ^ Тран Б., Браун А.М., Бедард П.Л., Винквист Э., Госс Г.Д., Хотте С.Дж., Велч С.А., Хирте Х.В., Чжан Т., Штейн Л.Д. , Ферретти В., Ватт С., Цзяо В., Нг К., Гай С., Шоу П., Петрочелли Т. , Hudson TJ , Neel BG, Onetto N, Siu LL, McPherson JD, Kamel-Reid S, Dancey JE (1 января 2012 г.). «Возможность секвенирования в реальном времени генов рака следующего поколения, связанных с ответом на лекарства: результаты клинических испытаний» . Int. J. Рак . 132 (7): 1547–55. DOI : 10.1002 / ijc.27817 . PMID 22948899 . S2CID 72705 .(требуется подписка)
- ^ Мюррей И.А., Кларк Т.А., Морган Р.Д., Бойтано М., Антон Б.П., Луонг К., Фоменков А., Тернер С.В., Корлах Дж., Робертс Р.Дж. (2 октября 2012 г.). «Метиломы шести бактерий» . Исследования нуклеиновых кислот . 40 (22): 11450–62. DOI : 10.1093 / NAR / gks891 . PMC 3526280 . PMID 23034806 .
- ^ "Набор Ion 520 и Ion 530 ExT - Chef - Thermo Fisher Scientific" . www.thermofisher.com .
- ^ «Архивная копия» . Архивировано из оригинала на 30 марта 2018 года . Проверено 29 марта 2018 года .CS1 maint: заархивированная копия как заголовок ( ссылка )
- ^ ван Влит А.Х. (1 января 2010 г.). «Секвенирование следующего поколения микробных транскриптомов: проблемы и возможности» . Письма о микробиологии FEMS . 302 (1): 1–7. DOI : 10.1111 / j.1574-6968.2009.01767.x . PMID 19735299 .
- ^ «БГИ и МГИСЕК» . en.mgitech.cn . Проверено 5 июля 2018 .
- ^ а б Хуанг Ю.Ф., Чен С.К., Чианг Ю.С., Чен Т.Х., Чиу КП (2012). «Палиндромная последовательность препятствует механизму секвенирования путем лигирования» . BMC Systems Biology . 6 Приложение 2: S10. DOI : 10.1186 / 1752-0509-6-S2-S10 . PMC 3521181 . PMID 23281822 .
- ^ Свободный, Мэтью; Ракьян, Вардхман; Холмс, Надин; Пейн, Александр (3 мая 2018 г.). «Наблюдение за китами с BulkVis: графический просмотрщик файлов Oxford Nanopore для массовых файлов fast5». bioRxiv 10.1101 / 312256 .
- ^ «Продажи PacBio начинают расти по мере того, как компания расширяет возможности продукта» .
- ^ «Мир Био-ИТ» . www.bio-itworld.com . Архивировано из оригинального 29 июля 2020 года . Проверено 16 ноября 2015 года .
- ^ «PacBio запускает высокопроизводительную и недорогую систему секвенирования одной молекулы» .
- ^ Кларк Дж, Ву ХК, Джаясингхе Л., Патель А., Рид С., Бейли Х. (апрель 2009 г.). «Непрерывная идентификация оснований для секвенирования ДНК с нанопорами одной молекулы». Природа Нанотехнологии . 4 (4): 265–70. Bibcode : 2009NatNa ... 4..265C . DOI : 10.1038 / nnano.2009.12 . PMID 19350039 .
- ^ а б Дела Торре Р., Ларкин Дж., Певица А., Меллер А. (2012). «Изготовление и характеристика массивов твердотельных нанопор для высокопроизводительного секвенирования ДНК» . Нанотехнологии . 23 (38): 385308. Bibcode : 2012Nanot..23L5308D . DOI : 10.1088 / 0957-4484 / 23/38/385308 . PMC 3557807 . PMID 22948520 .
- ^ а б Патхак Б., Лофас Х., Прасонгкит Дж., Григорьев А., Ахуджа Р., Шайхер Р.Х. (2012). «Двойные функционализированные золотые электроды с заделанными нанопорами для быстрого секвенирования ДНК» . Письма по прикладной физике . 100 (2): 023701. Bibcode : 2012ApPhL.100b3701P . DOI : 10.1063 / 1.3673335 .
- ^ Корлач Дж, Маркс П.Дж., Цицерон Р.Л., Грей Дж.Дж., Мерфи Д.Л., Ройтман Д.Б., Фам Т.Т., Отто Г.А., Фокет М., Тернер С.В. (2008). «Селективная пассивация алюминием для направленной иммобилизации одиночных молекул ДНК-полимеразы в волноводных наноструктурах с нулевой модой» . Труды Национальной академии наук . 105 (4): 1176–81. Bibcode : 2008PNAS..105.1176K . DOI : 10.1073 / pnas.0710982105 . PMC 2234111 . PMID 18216253 .
- ^ а б Шендуре Дж., Поррека Дж. Дж., Реппас Н. Б., Лин Х, МакКатчеон Дж. П., Розенбаум А. М., Ван М. Д., Чжан К., Митра Р. Д., Церковный генеральный директор (9 сентября 2005 г.). «Точное мультиплексное секвенирование полонии эволюционировавшего бактериального генома». Наука . 309 (5741): 1728–32. Bibcode : 2005Sci ... 309.1728S . DOI : 10.1126 / science.1117389 . PMID 16081699 . S2CID 11405973 .
- ^ Бентли Д. Р., Баласубраманиан С. и др. (2008). «Точное секвенирование всего человеческого генома с использованием химии обратимых терминаторов» . Природа . 456 (7218): 53–59. Bibcode : 2008Natur.456 ... 53В . DOI : 10,1038 / природа07517 . PMC 2581791 . PMID 18987734 .
- ^ Canard B, Sarfati S (13 октября 1994 г.), Новые производные, используемые для секвенирования нуклеиновых кислот , получено 9 марта 2016 г.
- ^ Канард Б., Сарфати Р.С. (октябрь 1994 г.). «Флуоресцентные субстраты ДНК-полимеразы с обратимыми 3'-метками». Джин . 148 (1): 1–6. DOI : 10.1016 / 0378-1119 (94) 90226-7 . PMID 7523248 .
- ^ Мардис ER (2008). «Методы секвенирования ДНК нового поколения». Анну Рев Геном Хум Генет . 9 : 387–402. DOI : 10.1146 / annurev.genom.9.081307.164359 . PMID 18576944 .
- ^ а б в Drmanac R, Sparks AB, Callow MJ, Halpern AL, Burns NL, Kermani BG и др. (Январь 2010 г.). «Секвенирование генома человека с использованием несвязанного основания считывает самособирающиеся наномассивы ДНК». Наука . 327 (5961): 78–81. Bibcode : 2010Sci ... 327 ... 78D . DOI : 10.1126 / science.1181498 . PMID 19892942 . S2CID 17309571 .
- ^ brandonvd. «О нас - полная геномика» . Полная геномика . Проверено 2 июля 2018 .
- ^ а б Хуанг Дж, Лян Х, Сюань И, Гэн Ц, Ли И, Лу Х и др. (Май 2017 г.). «Эталонный набор данных генома человека секвенатора BGISEQ-500» . GigaScience . 6 (5): 1–9. DOI : 10,1093 / gigascience / gix024 . PMC 5467036 . PMID 28379488 .
- ^ Валуев А., Итикава Дж., Тонтат Т., Стюарт Дж., Ранад С., Пекхэм Х., Зенг К., Малек Дж. А., Коста Дж., МакКернан К., Сидоу А., Файер А., Джонсон С. М. (июль 2008 г.). «Карта положения нуклеосом C. elegans с высоким разрешением показывает отсутствие универсального позиционирования, определяемого последовательностью» . Genome Res . 18 (7): 1051–63. DOI : 10.1101 / gr.076463.108 . PMC 2493394 . PMID 18477713 .
- ^ Раск Н (2011). «Торренты последовательности». Нат методы . 8 (1): 44. DOI : 10.1038 / nmeth.f.330 . S2CID 41040192 .
- ^ а б Drmanac R, Sparks AB и др. (2010). «Секвенирование генома человека с использованием считываний несвязанных оснований в самоорганизующихся наноразмерных массивах ДНК». Наука . 327 (5961): 78–81. Bibcode : 2010Sci ... 327 ... 78D . DOI : 10.1126 / science.1181498 . PMID 19892942 . S2CID 17309571 .
- ^ Porreca GJ (2010). «Секвенирование генома на наношарах». Природа Биотехнологии . 28 (1): 43–44. DOI : 10.1038 / nbt0110-43 . PMID 20062041 . S2CID 54557996 .
- ^ Complete Genomics Прессрелиз 2010
- ^ «Система секвенирования генов / генетического анализатора HeliScope: Helicos BioSciences» . 2 ноября 2009 года Архивировано из оригинала 2 ноября 2009 года.
- ^ Томпсон Дж. Ф., Штейнманн К. Э. (октябрь 2010 г.). Секвенирование отдельной молекулы с помощью системы генетического анализа HeliScope . Текущие протоколы в молекулярной биологии . Глава 7. С. Unit7.10. DOI : 10.1002 / 0471142727.mb0710s92 . ISBN 978-0471142720. PMC 2954431 . PMID 20890904 .
- ^ «Техническое объяснение tSMS SeqLL» . SeqLL. Архивировано из оригинала 8 -го августа 2014 года . Дата обращения 9 августа 2015 .
- ^ Хизер, Джеймс М .; Цепь, Бенджамин (январь 2016 г.). «Последовательность секвенаторов: история секвенирования ДНК» . Геномика . 107 (1): 1–8. DOI : 10.1016 / j.ygeno.2015.11.003 . ISSN 1089-8646 . PMC 4727787 . PMID 26554401 .
- ^ Сара Эль-Метвалли; Усама М. Оуда; Мохамед Хельми (2014). «Новые горизонты секвенирования следующего поколения». Технологии секвенирования нового поколения и проблемы сборки последовательностей . Технологии секвенирования нового поколения и проблемы сборки последовательностей, Springer Briefs in Systems Biology Volume 7 . SpringerBriefs по системной биологии. 7 . С. 51–59. DOI : 10.1007 / 978-1-4939-0715-1_6 . ISBN 978-1-4939-0714-4.
- ^ а б Ярмарка РБ, Хлыстов А., Портной Т.Д., Иванов В., Эванс Р.Д., Сринивасан В., Памула В.К., Поллак М.Г., Гриффин ПБ, Чжоу Дж. (Январь 2007 г.). «Химические и биологические применения цифровых микрофлюидных устройств». IEEE Design & Test of Computers . 24 (1): 10–24. CiteSeerX 10.1.1.559.1440 . DOI : 10,1109 / MDT.2007.8 . hdl : 10161/6987 . S2CID 10122940 .
- ^ а б Болес Д., Бентон Дж. Л., Сью Дж. Дж., Леви М. Х., Твар П. К., Сандал М. А. и др. (Ноябрь 2011 г.). «Капельное пиросеквенирование с использованием цифровой микрофлюидики» . Аналитическая химия . 83 (22): 8439–47. DOI : 10.1021 / ac201416j . PMC 3690483 . PMID 21932784 .
- ^ Зилионис Р., Наинис Дж., Верес А., Савова В., Земмур Д., Кляйн А. М., Мазутис Л. (январь 2017 г.). «Штрих-кодирование одной клетки и секвенирование с использованием капельной микрофлюидики». Протоколы природы . 12 (1): 44–73. DOI : 10.1038 / nprot.2016.154 . PMID 27929523 . S2CID 767782 .
- ^ "Гарвардская группа нанопор" . Mcb.harvard.edu. Архивировано из оригинального 21 февраля 2002 года . Проверено 15 ноября 2009 года .
- ^ «Секвенирование нанопор может снизить затраты на анализ ДНК» .
- ^ Патент США 20060029957 , ZS Генетика, «Система и методы анализа кислотных полимеров нуклеиновых и связанные с ними компоненты», выдаются 2005-07-14
- ^ Сюй М., Фудзита Д., Ханагата Н. (декабрь 2009 г.). «Перспективы и проблемы новых технологий секвенирования одномолекулярной ДНК». Маленький . 5 (23): 2638–49. DOI : 10.1002 / smll.200900976 . PMID 19904762 .
- ^ Шадт Э., Тернер С, Касарскис А (2010). «Окно в секвенирование третьего поколения» . Молекулярная генетика человека . 19 (R2): R227–40. DOI : 10,1093 / HMG / ddq416 . PMID 20858600 .
- ^ Сюй М., Эндрес Р.Г., Аракава Ю. (2007). «Электронные свойства основ ДНК». Маленький . 3 (9): 1539–43. DOI : 10.1002 / smll.200600732 . PMID 17786897 .
- ^ Ди Вентра М (2013). «Быстрое секвенирование ДНК электрическими средствами на несколько дюймов ближе» . Нанотехнологии . 24 (34): 342501. Bibcode : 2013Nanot..24H2501D . DOI : 10.1088 / 0957-4484 / 24/34/342501 . PMID 23899780 .
- ^ Оширо Т., Мацубара К., Цуцуи М., Фурухаши М., Танигучи М., Каваи Т. (2012). «Электрическое случайное переупорядочение одной молекулы ДНК и РНК» . Sci Rep . 2 : 501. Bibcode : 2012NatSR ... 2E.501O . DOI : 10.1038 / srep00501 . PMC 3392642 . PMID 22787559 .
- ^ Hanna GJ, Johnson VA, Kuritzkes DR, Richman DD, Martinez-Picado J, Sutton L, Hazelwood JD, D'Aquila RT (1 июля 2000 г.). «Сравнение секвенирования посредством гибридизации и циклического секвенирования для генотипирования обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека типа 1» . J. Clin. Microbiol . 38 (7): 2715–21. DOI : 10.1128 / JCM.38.7.2715-2721.2000 . PMC 87006 . PMID 10878069 .
- ^ а б Морей М., Фернандес-Мармиесс А., Кастиньейрас Д., Фрага Дж. М., Кус М. Л., Кочо Дж. А. (2013). «Взгляд в прошлое, настоящее и будущее секвенирования ДНК». Молекулярная генетика и метаболизм . 110 (1-2): 3-24. DOI : 10.1016 / j.ymgme.2013.04.024 . PMID 23742747 .
- ^ Цинь И, Шнайдер TM, Бреннер MP (2012). Гибас С (ред.). «Секвенирование путем гибридизации длинных мишеней» . PLOS ONE . 7 (5): e35819. Bibcode : 2012PLoSO ... 735819Q . DOI : 10.1371 / journal.pone.0035819 . PMC 3344849 . PMID 22574124 .
- ^ Эдвардс-младший, Рупарел Х., Джу-Дж. (2005). «Масс-спектрометрическое секвенирование ДНК». Мутационные исследования . 573 (1–2): 3–12. DOI : 10.1016 / j.mrfmmm.2004.07.021 . PMID 15829234 .
- ^ Холл Т.А., Бадоуле Б., Цзян И., Блин Л., Эшу М., Саннес-Лоури К.А., Сампат Р., Дрейдер Дж. Дж., Ханнис Дж. К., Харрелл П., Самант В., Уайт Н., Эккер Д. Д., Хофстадлер С. А. (2005) «Анализ основного состава митохондриальной ДНК человека с использованием масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением: новый инструмент для идентификации и дифференциации людей». Аналитическая биохимия . 344 (1): 53–69. DOI : 10.1016 / j.ab.2005.05.028 . PMID 16054106 .
- ^ Ховард Р., Энчева В., Томсон Дж., Бач К., Чан Ю. Т., Коуэн С., Дебенхэм П., Диксон А., Краузе Дж. У., Кришан И., Мур Д., Мур В., Оджо М., Родригес С., Стокс П., Уокер Дж., Циммерманн В. , Бараллон Р. (15 июня 2011 г.). «Сравнительный анализ митохондриальной ДНК человека из образцов костей времен Первой мировой войны с помощью секвенирования ДНК и масс-спектрометрии ESI-TOF». Международная судебная медицина: генетика . 7 (1): 1–9. DOI : 10.1016 / j.fsigen.2011.05.009 . PMID 21683667 .
- ^ Monforte JA, Becker CH (1 марта 1997 г.). «Высокопроизводительный анализ ДНК методом времяпролетной масс-спектрометрии». Природная медицина . 3 (3): 360–62. DOI : 10.1038 / nm0397-360 . PMID 9055869 . S2CID 28386145 .
- ^ Берес С.Б., Кэрролл Р.К., Ши П.Р., Ситкевич И., Мартинес-Гутьеррес Дж. К., Лоу ДЭ, МакГир А., Вилли Б.М., Грин К., Тиррелл Г.Дж., Голдман Т.Д., Фельдгарден М., Биррен Б.В., Фофанов Ю., Боос Дж., Уитон В. Хониш К., Мюссер Дж. М. (8 февраля 2010 г.). «Молекулярная сложность последовательных бактериальных эпидемий деконволютирована сравнительной патогеномикой» . Труды Национальной академии наук . 107 (9): 4371–76. Bibcode : 2010PNAS..107.4371B . DOI : 10.1073 / pnas.0911295107 . PMC 2840111 . PMID 20142485 .
- ^ Кан К.В., Фредлейк С.П., Доэрти Е.А., Бэррон А.Е. (1 ноября 2004 г.). «Секвенирование ДНК и генотипирование в миниатюрных системах электрофореза». Электрофорез . 25 (21–22): 3564–88. DOI : 10.1002 / elps.200406161 . PMID 15565709 . S2CID 4851728 .
- ^ Чен Й.Дж., Роллер Е.Е., Хуан Х (2010). «Секвенирование ДНК денатурацией: экспериментальное подтверждение концепции со встроенным жидкостным устройством» . Лаборатория на чипе . 10 (9): 1153–59. DOI : 10.1039 / b921417h . PMC 2881221 . PMID 20390134 .
- ^ Белл, округ Колумбия, Томас В.К., Муртаг К.М., Дионн Калифорния, Грэм А.С., Андерсон Дж. Э., Гловер В. Р. (9 октября 2012 г.). «Идентификация оснований ДНК с помощью электронной микроскопии». Микроскопия и микроанализ . 18 (5): 1049–53. Bibcode : 2012MiMic..18.1049B . DOI : 10.1017 / S1431927612012615 . PMID 23046798 .
- ^ Pareek CS, Smoczynski R, Tretyn A (ноябрь 2011 г.). «Технологии секвенирования и секвенирование генома» . Журнал прикладной генетики . 52 (4): 413–35. DOI : 10.1007 / s13353-011-0057-х . PMC 3189340 . PMID 21698376 .
- ^ Парик Ч.С., Смочинский Р., Третьин А (2011). «Технологии секвенирования и секвенирование генома» . Журнал прикладной генетики . 52 (4): 413–35. DOI : 10.1007 / s13353-011-0057-х . PMC 3189340 . PMID 21698376 .
- ^ Fujimori S, Hirai N, Ohashi H, Masuoka K, Nishikimi A, Fukui Y, Washio T, Oshikubo T., Yamashita T., Miyamoto-Sato E (2012). «Секвенирование нового поколения в сочетании с технологией бесклеточного отображения для высокопроизводительного получения надежных данных для взаимодействия» . Научные отчеты . 2 : 691. Bibcode : 2012NatSR ... 2E.691F . DOI : 10.1038 / srep00691 . PMC 3466446 . PMID 23056904 .
- ^ Харберс М (2008). «Текущее состояние клонирования кДНК». Геномика . 91 (3): 232–42. DOI : 10.1016 / j.ygeno.2007.11.004 . PMID 18222633 .
- ^ Альберти А., Белсер С., Энгелен С., Бертран Л., Орвен С., Бринас Л., Круод С. и др. (2014). «Сравнение методов подготовки библиотек показывает их влияние на интерпретацию метатранскриптомических данных» . BMC Genomics . 15 : 912–12. DOI : 10.1186 / 1471-2164-15-912 . PMC 4213505 . PMID 25331572 .
- ^ «Масштабируемая оценка качества нуклеиновых кислот для подготовки библиотеки секвенирования нового поколения Illumina» (PDF) . Проверено 27 декабря 2017 года .
- ^ "Archon Genomics XPRIZE" . Archon Genomics XPRIZE . Архивировано из оригинального 17 июня 2013 года . Проверено 9 августа 2007 года .
- ^ «Информация о гранте» . Национальный институт исследования генома человека (NHGRI) .
- ^ Северин Дж., Лизио М., Харшбаргер Дж., Кавадзи Х., Дауб КО, Хаяшизаки Ю., Бертин Н., Форрест А. Р. (2014). «Интерактивная визуализация и анализ крупномасштабных наборов данных секвенирования с использованием ZENBU». Nat. Biotechnol . 32 (3): 217–19. DOI : 10.1038 / nbt.2840 . PMID 24727769 . S2CID 26575621 .
- ^ Шмилович А., Бен-Гал И. (2007). «Использование модели VOM для реконструкции потенциальных кодирующих областей в последовательностях EST» (PDF) . Вычислительная статистика . 22 (1): 49–69. DOI : 10.1007 / s00180-007-0021-8 . S2CID 2737235 .
- ^ Дель Фаббро С, Скалабрин С, Морганте М, Джордж FM (2013). «Обширная оценка влияния обрезки считывания на анализ данных Illumina NGS» . PLOS ONE . 8 (12): e85024. Bibcode : 2013PLoSO ... 885024D . DOI : 10.1371 / journal.pone.0085024 . PMC 3871669 . PMID 24376861 .
- ^ Мартин, Марсель (2 мая 2011 г.). «Cutadapt удаляет последовательности адаптеров из высокопроизводительных операций секвенирования». EMBnet.journal . 17 (1): 10. DOI : 10,14806 / ej.17.1.200 .
- ^ Смедс Л., Кюнстнер А. (19 октября 2011 г.). «ConDeTri - зависимый от содержимого триммер чтения для данных Illumina» . PLOS ONE . 6 (10): e26314. Bibcode : 2011PLoSO ... 626314S . DOI : 10.1371 / journal.pone.0026314 . PMC 3198461 . PMID 22039460 .
- ^ Prezza N, Del Fabbro C, Vezzi F, De Paoli E, Policriti A (2012). ERNE-BS5: Выравнивание обработанных BS последовательностей множественными ударами по 5-буквенному алфавиту . Материалы конференции ACM по биоинформатике, вычислительной биологии и биомедицине . 12 . С. 12–19. DOI : 10.1145 / 2382936.2382938 . ISBN 9781450316705. S2CID 5673753 .
- ^ Шмидер Р., Эдвардс Р. (март 2011 г.). «Контроль качества и предварительная обработка наборов метагеномных данных» . Биоинформатика . 27 (6): 863–4. DOI : 10.1093 / биоинформатики / btr026 . PMC 3051327 . PMID 21278185 .
- ^ Болджер А.М., Лозе М., Усадель Б (август 2014 г.). «Trimmomatic: гибкий триммер для данных последовательности Illumina» . Биоинформатика . 30 (15): 2114–20. DOI : 10.1093 / биоинформатики / btu170 . PMC 4103590 . PMID 24695404 .
- ^ Кокс МП, Петерсон Д.А., Биггс П.Д. (сентябрь 2010 г.) «SolexaQA: Краткая оценка качества данных секвенирования второго поколения Illumina» . BMC Bioinformatics . 11 (1): 485. DOI : 10,1186 / 1471-2105-11-485 . PMC 2956736 . PMID 20875133 .
- ^ Мюррей TH (январь 1991 г.). «Этические вопросы исследования генома человека». Журнал FASEB . 5 (1): 55–60. DOI : 10.1096 / fasebj.5.1.1825074 . PMID 1825074 . S2CID 20009748 .
- ^ а б в Робертсон Дж. А. (август 2003 г.). «Геном за 1000 долларов: этические и юридические вопросы при секвенировании всего генома людей». Американский журнал биоэтики . 3 (3): W – IF1. DOI : 10.1162 / 152651603322874762 . PMID 14735880 . S2CID 15357657 .
- ^ а б Хендерсон, Марк (9 сентября 2013 г.). «Секвенирование генома человека: настоящие этические дилеммы» . Хранитель . Дата обращения 20 мая 2015 .
- ^ Хармон, Эми (24 февраля 2008 г.). «Страховые страхи заставляют многих избегать тестов ДНК» . Нью-Йорк Таймс . Дата обращения 20 мая 2015 .
- ↑ Заявление об административной политике , Исполнительная канцелярия президента, Управление и бюджет, 27 апреля 2007 г.
- ^ Национальный институт исследования генома человека (21 мая 2008 г.). «Президент Буш подписывает Закон о недискриминации в области генетической информации 2008 года» . Проверено 17 февраля 2014 года .
- ^ Бейкер, Моня. «Комиссия по этике США сообщает о секвенировании ДНК и конфиденциальности» . Новый блог о природе . Дата обращения 20 мая 2015 .
- ^ «Конфиденциальность и прогресс в секвенировании всего генома» (PDF) . Президентская комиссия по изучению вопросов биоэтики. Архивировано из оригинального (PDF) 12 июня 2015 года . Дата обращения 20 мая 2015 .
- ^ ДНК в вашем мусоре: готово для захвата
- ^ Гольденберг А.Дж., Шарп Р.Р. (февраль 2012 г.). «Этические опасности и программные проблемы геномного скрининга новорожденных» . ДЖАМА . 307 (5): 461–2. DOI : 10,1001 / jama.2012.68 . PMC 3868436 . PMID 22298675 .
- ^ Хьюз, Вирджиния (7 января 2013 г.). «Пора перестать зацикливаться на опасности генетической информации» . Журнал Slate . Дата обращения 22 мая 2015 .
- ^ а б Bloss CS, Schork NJ, Topol EJ (февраль 2011 г.). «Эффект прямого геномного профилирования для оценки риска заболевания» . Медицинский журнал Новой Англии . 364 (6): 524–34. DOI : 10.1056 / NEJMoa1011893 . PMC 3786730 . PMID 21226570 .
- ^ Рохман, Бонни (25 октября 2012 г.). «Что ваш доктор не говорит вам о вашей ДНК» . Time.com . Дата обращения 22 мая 2015 .
Внешние ссылки
- Wikibook на следующей последовательности поколения
- Бесплатно дидактический справочник для анализа секвенирования ДНК.
- Путь к последовательности ДНК: Жизнь и работа Fred Sanger
- США Карта секвенсоры нового поколения