Аллель-специфический олигонуклеотид
Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Аллель-специфический олигонуклеотид ( АСО ) представляет собой короткий кусок синтетической ДНК , комплементарные к последовательности переменной целевой ДНК. Он действует как зонд на наличие мишени в анализе саузерн-блоттингом или, чаще, в более простом анализе дот-блоттинга . Это распространенный инструмент, используемый в генетическом тестировании , судебной медицине и исследованиях молекулярной биологии .

ASO обычно представляет собой олигонуклеотид длиной 15–21 нуклеотидное основание . Он разработан (и используется) таким образом, что он специфичен только для одной версии или аллеля тестируемой ДНК. Длина ASO, из какой цепи она выбрана, и условия, при которых она связана (и отмывается) от целевой ДНК, - все это играет роль в ее специфичности. Эти зонды обычно могут быть разработаны для обнаружения различий всего в 1 основание в генетической последовательности мишени, что является основной способностью анализа однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), что важно для анализа генотипов и проекта «Геном человека».. Чтобы быть обнаруженным после того, как он привязался к своей цели, ASO должен быть помечен радиоактивной, ферментативной или флуоресцентной меткой. Технология анализа метилирования Illumina использует преимущества ASO для обнаружения разницы в одной паре оснований (цитозин по сравнению с тимином) для измерения метилирования в конкретном сайте CpG.

Пример

Связывание зонда ASO «S» с ДНК «S» (вверху) или ДНК «A» (внизу).

Болезнь человека серповидно - клеточной анемии вызвана генетической мутацией в кодоне для шестой аминокислоты из белка крови бета-гемоглобина . Нормальная последовательность ДНК GAG кодирует глутамат аминокислоты , в то время как мутация изменяет средний аденин на тимин , что приводит к последовательности GTG (GUG в мРНК ). Эта измененная последовательность заменяет валин в конечном белке, искажая его структуру.

Чтобы проверить наличие мутации в образце ДНК, зонд ASO должен быть синтезирован, чтобы быть комплементарным измененной последовательности, [1] здесь обозначенной как «S». В качестве контроля будет синтезирован другой ASO для нормальной последовательности «A». Каждый ASO полностью комплементарен своей целевой последовательности (и будет сильно связываться), но имеет одно несоответствие со своим нецелевым аллелем (что приводит к более слабому взаимодействию). На первой диаграмме показано, как зонд «S» полностью дополняет цель «S» (вверху), но частично не соответствует цели «A» (внизу).

Схема дот-блотов с использованием зондов ASO «A» или «S».

Сегмент генов бета-гемоглобина в образце ДНК (ах) будет амплифицирован с помощью ПЦР, и полученные продукты будут применяться для дублирования поддерживающих мембран в виде дот-блотов . Нити ДНК образца разделяются щелочью, и каждый зонд ASO наносится на отдельный блот. После гибридизации используется протокол промывки, который позволяет различать полностью комплементарные и несовпадающие гибриды. Несоответствующие ASO смываются с блотов, в то время как совпадающие ASO (и их метки) остаются.

На второй диаграмме шесть образцов амплифицированной ДНК были нанесены на каждый из двух блотов. Обнаружение метки ASO, которая остается после промывки, позволяет напрямую считывать генотип образцов, каждый из которых содержит две копии гена бета-гемоглобина. Образцы 1 и 4 имеют только нормальный аллель «A», тогда как образцы 3 и 5 имеют аллели «A» и «S» (и поэтому являются гетерозиготными носителями этой рецессивной мутации ). Образцы 2 и 6 имеют только аллель «S» и могут быть затронуты этим заболеванием. Показанная небольшая степень «перекрестной гибридизации» является типичной и учитывается в процессе интерпретации окончательных результатов.

Альтернативы

ASO-анализ - лишь один из методов, используемых для выявления генетических полиморфизмов. Прямое секвенирование ДНК используется для первоначальной характеристики мутации, но оно слишком трудоемко для рутинного скрининга. Более ранний метод, полиморфизм длины рестрикционного фрагмента (RFLP), не требовал заранее знать изменение последовательности, но требовал, чтобы мутация влияла на сайт расщепления рестрикционного фермента . Анализа ПДРФ был на короткое время адаптирована к использованию олигонуклеотидных зондов , [2] , но эта техника была быстро вытеснена ASO анализ полимеразной цепной реакции (ПЦР) амплифицированной ДНК. Сам метод ПЦР был адаптирован для выявления полиморфизмов, как аллель-специфическая ПЦР.. Однако простота и универсальность комбинированного метода ПЦР / ASO привела к его постоянному использованию, в том числе с нерадиоактивными метками, и в формате «обратного дот-блоттинга», где зонды ASO связаны с мембраной и амплифицированным образцом ДНК. используется для гибридизации .

История

Использование синтетических олигонуклеотидов в качестве специфических зондов для вариаций генетической последовательности было впервые предложено Р. Брюсом Уоллесом, работающим в Национальном медицинском центре City of Hope в Дуарте, Калифорния . В 1979 году Уоллес и его коллеги сообщили об использовании зондов ASO для обнаружения вариаций в одноцепочечном бактериальном вирусе [3], а затем применили этот метод к клонированным генам человека. В 1983 [4] и 1985 [1] лаборатория Уоллеса сообщила об обнаружении мутации серповидно-клеточной анемии в образцах цельной геномной ДНК, хотя этому применению препятствовало небольшое количество метки, которую мог переносить ASO. [1]

К счастью, ПЦР, метод значительной амплификации определенного сегмента ДНК, также был описан в 1985 году. [2] Менее чем через год ПЦР была соединена с анализом ASO. [5] Эта комбинация решила проблему маркировки ASO, поскольку количество целевой ДНК можно было амплифицировать более чем в миллион раз. Кроме того, специфичность самого процесса ПЦР может быть добавлена ​​к специфичности зондов ASO, что значительно снижает проблему ложного связывания ASO с нецелевыми последовательностями. Комбинация была достаточно специфичной, чтобы ее можно было использовать в простом дот-блоте , избегая трудоемкого и неэффективного метода саузерн-блоттинга .

Другое использование

ASO-PCR также может использоваться для обнаружения минимального остаточного заболевания при раке крови, таком как множественная миелома . [6]

использованная литература

  1. ^ a b c Студенки А.Б., Коннер Б.Дж., Импраим С.С., Теплиц Р.Л. и Уоллес Р.Б. «Дискриминация генов бета-A, бета-S и бета-C-глобина человека с использованием зондов для аллель-специфической гибридизации олигонуклеотидов». Am J Hum Genet об. 37 (1), стр. 42–51 (1985).
  2. ^ а б Сайки, РК; Scharf S; Faloona F; Mullis KB; Рог GT; Erlich HA; Arnheim N (20 декабря 1985 г.). «Ферментативная амплификация геномных последовательностей бета-глобина и анализ сайтов рестрикции для диагностики серповидноклеточной анемии» . Наука . 230 (4732): 1350–4. Bibcode : 1985Sci ... 230.1350S . DOI : 10.1126 / science.2999980 . PMID  2999980 . Архивировано из оригинального 19 декабря 2008 года.
  3. ^ Уоллес, РБ; Шаффер, Дж; Мерфи, РФ; Боннер, Дж; Hirose, T; Itakura, K (1979). «Гибридизация синтетических олигодезоксирибонуклеотидов с ДНК Phi-X 174: эффект несоответствия одной пары оснований» . Исследования нуклеиновых кислот . 6 (11): 3543–3558. DOI : 10.1093 / NAR / 6.11.3543 . PMC 327955 . PMID 158748 .  
  4. ^ Conner BJ, Reyes AA, Morin C, Itakura K, Teplitz RL и Wallace RB "Обнаружение бета-S-глобинового аллеля серповидных клеток путем гибридизации с синтетическими олигонуклеотидами". Proc Natl Acad Sci USA. т. 80 (1), стр. 278–282 (1983).
  5. ^ Saiki RK, Bugawan TL, Horn GT, Mullis KB и Erlich HE "Анализ ферментативно амплифицированной ДНК бета-глобина и HLA-DQ с аллель-специфическими олигонуклеотидными зондами" Nature vol. 324 (6093), стр. 163–166 (1986).
  6. ^ Каерс, Джо; Гардере, Лоран; Кортум, К. Мартин; О'Дуайер, Майкл Э .; ван де Донк, Нильс WCJ; Биндер, Маша; Долд, Сандра Мария; Гей, Франческа; Корре, Джилл; Бегин, Ив; Людвиг, Хайнц (ноябрь 2018 г.). «Рекомендации Европейской сети миеломы по инструментам для диагностики и мониторинга множественной миеломы: что использовать и когда» . Haematologica . 103 (11): 1772–1784. DOI : 10,3324 / haematol.2018.189159 . ISSN 0390-6078 . PMC 6278986 . PMID 30171031 .   

внешние ссылки

  • Изображение авторадиограммы ASO
Источник « https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Allele-specific_oligonucleotide&oldid=1032567252 »
Contribute a better translation