Олигонуклеотиды представляют собой короткие молекулы ДНК или РНК , олигомеры , которые находят широкое применение в генетическом тестировании , исследованиях и судебной экспертизе . Обычно получаемые в лаборатории с помощью твердофазного химического синтеза [1] , эти небольшие фрагменты нуклеиновых кислот могут быть получены в виде одноцепочечных молекул с любой заданной пользователем последовательностью, поэтому они жизненно важны для синтеза искусственных генов , полимеразной цепной реакции (ПЦР). ), секвенирование ДНК , молекулярное клонирование и в качестве молекулярных зондов. В природе олигонуклеотиды обычно встречаются в виде небольших молекул РНК, которые участвуют в регуляции экспрессии генов (например , микроРНК ) [2] или являются промежуточными продуктами деградации, образующимися при распаде более крупных молекул нуклеиновых кислот.
Олигонуклеотиды характеризуются последовательностью нуклеотидных остатков , составляющих всю молекулу. Длину олигонуклеотида обычно обозначают « -mer » (от греческого meros , «часть»). Например, олигонуклеотид из шести нуклеотидов (нт) представляет собой гексамер, тогда как один из 25 нт обычно называют «25-мером». Олигонуклеотиды легко связываются специфичным для последовательности образом с соответствующими комплементарными олигонуклеотидами, ДНК или РНК с образованием дуплексов или, реже, гибридов более высокого порядка. Это основное свойство служит основой для использования олигонуклеотидов в качестве зондов .для обнаружения определенных последовательностей ДНК или РНК. Примеры процедур, в которых используются олигонуклеотиды, включают ДНК-микрочипы , Саузерн-блоты , анализ ASO , [3] флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH), ПЦР и синтез искусственных генов.
Олигонуклеотиды состоят из 2'-дезоксирибонуклеотидов (олигодезоксирибонуклеотидов), которые можно модифицировать в основной цепи или в положении 2' сахара для достижения различных фармакологических эффектов. Эти модификации придают новые свойства олигонуклеотидам и делают их ключевым элементом антисмысловой терапии . [4] [5]
Олигонуклеотиды химически синтезируются с использованием строительных блоков, защищенных фосфорамидитов природных или химически модифицированных нуклеозидов или, в меньшей степени, ненуклеозидных соединений. Сборка олигонуклеотидной цепи происходит в направлении от 3' к 5' в соответствии с обычной процедурой, называемой «синтетическим циклом». Завершение одного синтетического цикла приводит к добавлению одного нуклеотидного остатка к растущей цепи. Выход менее 100% на каждой стадии синтеза и возникновение побочных реакций устанавливают практические пределы эффективности процесса. В целом последовательности олигонуклеотидов обычно короткие (длиной 13-25 нуклеотидов). [6] Максимальная длина синтетических олигонуклеотидов едва превышает 200 нуклеотидных остатков.ВЭЖХ и другие методы можно использовать для выделения продуктов с желаемой последовательностью.
Создание химически стабильных коротких олигонуклеотидов было самой ранней задачей при разработке терапии АСО. Встречающиеся в природе олигонуклеотиды легко расщепляются нуклеазами, ферментом, расщепляющим нуклеотиды и присутствующим в клетках любого типа. [7] Короткие олигонуклеотидные последовательности также обладают слабой внутренней аффинностью связывания, что способствует их деградации in vivo. [8]
Нуклеозидорганотиофосфатные ( PS ) аналоги нуклеотидов придают олигонуклеотидам некоторые полезные свойства. Ключевыми полезными свойствами, которые каркасы PS придают нуклеотидам, являются диастереомерная идентификация каждого нуклеотида и способность легко отслеживать реакции с участием фосфоротиоатных нуклеотидов, что полезно при синтезе олигонуклеотидов. [9] Модификации скелета полистирола в олигонуклеотидах защищают их от нежелательной деградации ферментами. [10] Модификация нуклеотидного остова широко используется, потому что ее можно осуществить с относительной легкостью и точностью для большинства нуклеотидов. [9]Сообщалось, что флуоресцентные модификации на 5'- и 3'-концах олигонуклеотидов позволяют оценить структуру, динамику и взаимодействие олигонуклеотидов с окружающей средой. [11]